胶原蛋白提取及氨基酸序列

管圆线虫胶原蛋白基因的测序与表达生命科学学院08级3班09080319吴星星胶原蛋白介绍胶原蛋白又名胶原质，是由动物细胞合成的一种生物性高分子，是构成动物结缔组织的主要蛋白质，广泛存在于骨、腱、软骨、皮肤等结缔组织中，在脊椎动物中约占总蛋白的1/3。最常见的3种胶原是I型、II型、III型胶原，其中I型胶原是成年动物皮中的主要胶原形式。胶原蛋白中脯氨酸和羟脯氨酸的含量是各种蛋白质中含量最高的［1］。蛋白质是一切生命体必不可少的组成部分，胶原作为一大类蛋白质，在生物体内起着重要作用。由于胶原蛋白有诸多优良性质,使这类生物高分子化合物用途非常广泛，遍及医药、化工、食品等领域［2］。胶原蛋白具有巨大的开发潜力和利用价值。随着科学技术的发展，人们对胶原的应用越来越广泛，对胶原蛋白的需求越来越大，如何既经济又快速获得胶原蛋白已成为人们关注的课题。〈一〉实验材料介绍广州管圆线虫病(Angiostrongyliasis)是由广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)幼虫寄生于人体中枢神经系统而引发的疾病。人感染广州管圆线虫后幼虫在人体内移行，侵犯中枢神经系统，引起脑组织病变。患者出现嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎或脑膜炎。临床症状主要为急性剧烈头痛；其次为恶心、呕吐、发热及颈项强直严重病例可有瘫痪、嗜睡、昏迷，甚至死亡作为一种新发传染病的病原，广州管圆线虫的许多生物学特性，特别是分子生物学方面，还未被人们所认知。鉴于广州管圆线虫在人体的感染和致病阶段主要为幼虫，本实验根据广州管圆线虫幼虫的cDNA文库表达序列标签(expressionsequencetag,EST)测序结果，采用PCR技术克隆并鉴定了广州管圆线虫胶原蛋白(collagen,COL)基因的全长cDNA序列，并构建了其原核表达重组质粒为下一步的深入研究奠定了基础。胶原蛋白的提取1.1实验原料广州光源线虫1.2仪器设备BeckmanLG10-2.4A冷冻离心机;UnicoUV-2102紫外分光光度计;ALPHAL-2冻干机;DYY-1电泳仪:；自动定氮仪:KTJELTEC,Auto1030Analyzer;835-50型氨基酸分析仪:;WR-2001溶剂过滤器：1.3试剂材料胃蛋白酶、胰酶:，三氯乙酸，对二甲氨基苯甲醛，氯氨T,高氯酸，巯基乙醇，柠檬酸缓冲液等。所有试剂均为分析纯;超滤膜:TS-100,CXA-50,实验方法1.4.1酶法提取胶原蛋白本实验选用胰酶、胃蛋白酶进行酶解，提取管园线虫的胶原蛋白。按原料：缓冲液(PH8〜9)1：3匀浆，加入胰酶搅拌均匀，在45°C酶解4h,沸水浴灭酶10min,5000r/min离心15min,取上清液，将上清液冷冻干燥保存。去脂去杂蛋白的线虫按原料：缓冲液(pH2)1：7匀浆，加入胃蛋白酶搅拌均匀，在37C酶解6h,沸水浴灭酶10min,7000r/min离心15min,取上清液，将上清液冷冻干燥保存。补充：酶法提取胶原蛋白具体原理胶原蛋白是由三股螺旋组成的，分子量在30万u,每条肽链的分子量大约为10万u。因胶原蛋白酶对胶原蛋白的水解主要破坏胶原的螺旋区使胶原蛋白水解为小分子肽类及游离氨基

酸，而其他蛋白酶对胶原蛋白的酶解促滔只是切除胶原蛋白的尾肽,使其变为可溶[4],所以用胃蛋白酶促溶的胶原蛋白溶液同原胶原具有相同的形状、大小及氨基酸组成，同酸溶性胶原蛋白在性质上无显著不同[5],胃蛋白酶水解胶原蛋白是在37°C,胶原蛋白没有变性[6],从图1第4泳道的谱带可确定所提出的胶原蛋白为天然的、未变性的大分子胶原蛋白。97.4ku66.2ku43+Oku31.Oku2O.!kuI4.4kuL标准蛋白应.被截留值为10万的超滤膜栽流的胶原蚩门提取物

（蛆分03.被截留值为10万的超滤膜滤过的般原蛋白提取物（组分

2）:4.胃酶水解后提取物'图I胃蛋白酶提取胶原蛋白的电泳图谱胃蛋白酶提出的胶原蛋白粗品分子量在7.8X104〜9.9X104U范围内，如图1所示，说明样品的结构保持了肽链的完整性。然而当胃蛋白酶提取物被截留值为10万的超滤膜分离之后，样品却被分解，形成了小分子量片段，反而破坏了胃蛋白酶提取的胶原蛋白的结构。从被分离的两组分样品的分子量测定结果可以看出胃蛋白酶提取物无法被超滤膜完全分离。这可能因为胃蛋白酶提取物的冻干粉溶解于PH2的缓冲液中，形成了十分黏稠的液体，无法穿透超滤膜，不利于超滤；并且胃蛋白酶提取的胶原蛋白粗品从电泳图谱来看分子量相差不大，因此，用胃蛋白酶提取的胶原蛋白不需再进一步分离。根据电泳结果胰酶提取得到的胶原蛋白样品分子量分布在3.2X104〜5.1X104u之间，说明胰酶的水解力较强，已经把胶原蛋白水解为小分子片段。分别用截留值为10万和5万的超滤膜进行分离，不同组分收集到的产物用SDS-PAGE电泳测得的分子量结果相近都在2〜3万u之间。胶原蛋白中氨基酸组成及含量氨基酸组成分析表2胶原蛋白中氨基酸组成及含量氨基酸名称Sigma标准蛋白胶原蛋白（胰酶提胶原蛋白（胃酶提含量/%aa个数取）含量/%aa个数取）含量/%aa个数氨基酸名称Asp3.614.787.396.256.285.43Thr1.251.661.941.841.881.82Ser1.22.012.322.482.482.72Glu6.749.0612.399.6511.519.00Pro9.0113.7815.1114.7816.2816.30Gly11.1426.1019.7629.6316.4124.73Ala5.9711.808.8411.179.5312.30Val1.872.803.38Met0.540.641.180.851.010.78Ile0.931.241.931.661.401.22Leu2.042.733.533.023.513.07Tyr80.920.730.47Phe1.421.512.681.822.511.74Lys2.432.923.852.974.263.35His0.460.521.330.960.890.66Arg4.804.843.172.028.735.76Hyp6.458.668.496.788.517.47合计60.0310098.7210098.89100用酶法提取出的胶原蛋白其氨基酸组成和含量与Sigma胶原蛋白标准品比较，结果如表2所示。对表2的数据进行分析可以看出，在用胰酶和胃蛋白酶提取出的胶原蛋白中，甘氨酸的含量分别19.76和16.41%,而sigma胶原蛋白标准品中甘氨酸的含量是11.14%。胶原蛋白1是由两条a1(1)和一条a2组合而成的三股螺旋，一级结构表明，a肽链的96%都是按三联体的重复顺序(Gly-x-y)n排列而成的,Gly数目占残基总数的1/3[1]。表2的数据显示胰酶和胃蛋白酶提取出的胶原蛋白中每100个氨基酸中Gly的残基数分别为29.63和24.73个而Sigma胶原蛋白标准品中甘氨酸的残基数为26.10个。Sigma胶原蛋白标准品中氨基酸的总量仅占60.03%,其余为一些盐类杂质，这从SDS-PAGE的电泳图谱中也得到了验证,但在它的蛋白组成中，胶原蛋白的含量占95%,达到了较高的纯度。本实验用胰酶和胃蛋白酶提取出的胶原蛋白中，蛋白含量分别为98.72%和98.89%,蛋白含量都高于sigma胶原蛋白标准品，但纯度略低，分别为81%和84%。若经过适当的纯化处理，可提高其纯度。如本实验中用胰酶提取的胶原蛋白用截留值为5万的超滤膜分离，在滤过组分的蛋白中胶原蛋白的含量87%。胶原蛋白全长cDNA的克隆及PCR扩增材料1.1文库广州管圆线虫幼虫的cDNA文库由本室用CLONTECH的SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建，文库的初始滴度为2.19X106pfu/ml[3]。1.2菌株与质粒大肠埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)DH5a株和BL21株、原核表达质粒pET32a(+)为本室保存;pMD18-T载体购于大连宝生物工程有限公司。1.3主要试剂限制性内切酶为MBI公司产品;T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、dNTP为大连宝生物工程有限公司产品；琼脂糖、胰蛋白胨和酵母提取物为英国Oxoid公司产品；其余试剂为国产分析纯。测序由上海英骏生物技术有限公司完成。PCR反应引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。方法EST分析通过NCBI数据库(http:///BLAST/)Blastn,Blastx程序分别在核苷酸及蛋白质水平上对本室已获得的广州管圆线虫幼虫的EST序列进行同源性搜索。2.2PCR分段扩增新基因CDNA序列用DNAMAN软件设计所需的引物。选出文库载体插入位点上游和下游的序列设计一对引物：上游引物P1:5'-GAAGCGCGCCATTGTGTTG-3Z;下游引物P2:5Z-CTATAGGGCGAATTGGCCAC-3，。选取EST序列中段测序非常准确的部分(长度为179bp)设计一对引物：上游引物P3:5，-AGCACATGAATCCATCTGG-3，;下游引物P4:5，-CATTTCCGGGCAATCCAGG-3，。以幼虫的cDNA文库为模板，分别以P1和P4,P3和P2组合的两对引物进行CDNA序列分段扩增；反应条件为：预变性94°C5min,变性94°C30s,退火55°C30s,延伸72°C2min,共30个循环，再72C延伸7min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定°PCR产物回收纯化后连接pMD18-T载体，转化大肠埃希菌DH5a株，并筛选出阳性克隆测序。2.3序列拼接及全长CDNA序列克隆上述分段扩增获得的两段序列测序后去除载体上的序列，利用DNAMAN软件进行拼接获得CDNA全长序列，根据cDNA全长序列，包含从ATG至TAA为止的全编码区，设计引物：上游引物P5:5，-CAGGATCCATGAGTAAAGTGACTGC-3，,在5，端引入BamHI酶切位点及保护碱基；下游引物P6:5，-CTGAAGCTTTTAGAAGCGTCGCTTTC-3，，在5，端引入Hindlll酶切位点及保护碱基。以幼虫的CDNA文库为模板，以P5、P6为引物进行PCR扩增，反应条件为：预变性94C5min,变性94°C30s,退火58C30s,延伸72°C80s,共30个循环，再72°C延伸7min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定°PCR产物回收纯化后进行T-A克隆，转化大肠埃希菌DH5a株,并筛选出阳性克隆测序。2.4对全长CDNA序列进行结构分析及鉴定将得到的广州管圆线虫新基因全长CDNA序列递交NCBI网站(http:///),通过Blastx程序在非冗余序列数据库(nr)进行同源性搜索；利用ExPASy网站(/)提供的软件工具进行序列结构分析，内容包括寻找核苷酸序列中的开放阅读框(openreadingframe,ORF)、推导编码的氨基酸序列及其分子量、等电点以及搜索其重要的功能位点等。采用在线SMART服务器(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析其编码的蛋白质序列的结构功能域。2.5原核表达重组质粒的构建将含有新基因全编码区的重组T载体经BamHI/HindIII双酶切后切下新基因，酶切产物纯化后导入原核表达质粒pET32a(+)中构建重组表达质粒BamHI、HindIII双酶切及测序鉴定无误后将该质粒转化入大肠杆菌BL21进行原核表达。3.检测结果ESTBlast结果在本室已获得的广州管圆线虫幼虫的EST序列中，编号172克隆的CDNA序列(片段长565bp,dbEST登陆号为giI17560252IrefINP.504525.1I)与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)胶原蛋白的mRNA有较高的同一性。PCR结果用所设计的引物以幼虫的CDNA文库为模板，扩增的广州管圆线虫胶原蛋白(ACCOL)EST的中段序列及分段扩增得到的两段CDNA序列(包括文库载体上引物序列)长度分别为179bp、415bp、1028bp(图1)。扩增的ACCOL编码区全长为873bp(图2)。

图1广州管圆线虫胶原蛋白全长cDNA序列RacelikePCR扩增结果bp900800bp900800600图2PCR扩增广州管圆线虫胶原蛋白全长ORF序列结果3.3广州管圆线虫胶原蛋白全长cDNA序列及氨基酸序列将上述扩增获得的广州管圆线虫新基因AcCOL的前后两段cDNA序列的测序结果进行拼接,去除载体上序列得到长度为1123bp的AcCOL全长cDNA序列，该序列包含一个873bp的ORF,由起始密码子ATG至终止密码子TAA止，其间编码290个氨基酸；在cDNA序列上5’端有起始密码子ATG,其附近序列符合Kozak规则,3’端有终止密码子及polyA加尾信号（图3）I AGTCACACGGCAATCATGASTAAAGTGACTGCGATCGCCTOGCdGGTCACGCTTACWIII HSKV7AIGSGVTLTV61 GTGGIGTGTTCGCTTGTT航TATGArCTCATTACTGAAAGATATTGCTGArCTICGATTTVVCSLVTNIISLLKLIiDLRF121 ICGAAGTaAGCaTCCaTG^TTTAKlXCATT虻CGKCAC心询"C心TT3E EVEVSHDEFKCITDDTtSHIIS1 CTCACTJLfiGCACATGAATCCATCTtXTJIGfTiXAfiTKtl&CMrAAATATTCCTATGATA5S LTKHIUNFS^SSSAAFKIARI网1 CTTK心TCGCCCTCGTKCGTKGATTCCCTCAKACT&CAACTGTG&&OCAAAATCALGRRPRAVtFPEQCffCGPKS301 ACTGGITGTCCACC7GGA0CTCCTGGAOCACCMGACCAAAAGWCTNCTWATTCCCC96 TGCFPGPPGPPGFEGLPGLP361 GGAAATGATCGCGAGGATSGACKCCTWTGCTCCAKACCTKGATCSCCATIACTCAC116 GNDGEDGRFGAFGFAIAITH421 GjOTTOCIGGTGCTTGCATT心TGTCCAGCTGGTCCCCC邮GACCACGrWGCCACCT136 CIPGCCITCPA&PPGPRGPPg1 gg^aajccagc^icckgaccaccacgaatattcgcccatcctixaccgccac&tcca156 CEPCPPGAPGIFGHRCPPCP网1 CCAGGCCCAATGGGA&AAA7TGGACCGCAAGGAGAO；AA&&M1&TCACCTCT(；CCACGI|7fi PGPTGEIGFqGDEGNSGVPG网1 CGTCCAW就CWX朋GACAACCTCGTG朋CCCCGAAO^HTACAGTCAAGGCAreCCG196 RFGPPGqPGEPGTQTSQGirFB61 GGACATCCTCGCCCACCAGGACAAMAKACCACCGWA&AAO：CGGACMKKGGTGT&216 GHFGPPGORGPPGEFGQPGT721 CC疝GTiUCGACKCAAGCCTGG^CACAAGtTCGAmJG&TCIACCTGGAAAGGATWA236 PGNDCKPGFqGRP&LPGEDG7S1 CATOCTGGMGGAACGWCAACCTGG心GAGAGGTGAA1ATGGAA胳GTTGCAGCCGAT266 HPGEHGqPGQRGEMGKYGBD641 GCCGAArACTGTCC：TGCCCACCGCGTGGTCGAAACCGACCCTTCrAATTTGA：TiCCAT276 AEYCPCPPXCRKRRF*90