髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG抗原肽免疫原性验证

纪％大学毕业论文题目.髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG抗原肽免 疫原性验证 学生姓名： XXX学号：XXXXXXXXX指导教师：XXX职称：教授专业： 生物技术 院（系）： 生物工程系 完成时间：2011年5月25日2011年5月25日摘要目的:通过实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE）小鼠模型的建立，验证固相合成法制备的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）抗原肽免疫原性。并通过观察EAE病理学变化，初步探讨多发性硬化（MS）的发病机制。方法：本实验室利用Fmoc固相合成法制备的MOG35~55抗原肽（纯度＞95%）加完全弗氏佐剂（CFA）免疫C57BL/6小鼠，观察小鼠发病情况，并采用双盲法进行神经功能评分。利用电子显微镜观察EAE小鼠的病理学变化，分别采用HE染色、LuxolFastBlue髓鞘染色法评估脊髓中炎性细胞的浸润及髓鞘脱失的情况。结果：MOG35~55成功诱导了C57BL/6小鼠EAE模型。免疫后15天起，小鼠开始陆续出现临床症状，至第21天发病率达100%。电子显微镜下可见EAE小鼠脊髓中典型脱髓鞘现象，并伴随有典型的炎性细胞的浸润。结论：用本实验室合成的抗原肽MOG35~55诱导的C57BL/6小鼠EAE模型，发病率高，模型稳定，为进一步研究多发性硬化（multiplesclerosis,MS）的发病机制与治疗打下基础。关键词：髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、实验性自身免疫性脑脊髓炎、动物模型、神经病理学AbstractObjectiveThemodelofexperimentalautoimmuneencephalomyelitis(EAE)wasestablishedinfemaleC57BL/6micetovalidatetheimmunogenicityofmyelinoligodendrocyteglycoprotein(MOG),toobservepathologicalchangesofEAE,andtoexplorethepossiblepathogenesisofmultiplesclerosis(MS).MethodsEachmousewasinjecteds.coverflankswithMOG3555,MycobacteriumH37Ra,andCFA,injectedi.pwithpertussistoxin.TheclinicalsymptomswereobservedandthepathologicalchangesofEAEwerestudiedwiththeelectronmicroscopy.Consecutivesectionswerestainedwithhematoxylin/eosin(HE)andLuxolFastBlue(LFB),toassessinflammationanddemyelination.ResultsTheincidenceofEAEinimmunizationanimalreached100%,mostmicedevelopedclinicalEAEwithinabout15daysofimmunizationMOG35~55peptides.WithElectronmicroscopy,inflammatorycellsinwhitematteranddemyelinationwereobserved.Andthecomponentofaxonisdisappeared.ConclusionTheimmunogenicityofMOG~synthesizedbytheimprovedsolid-phasesynthesismethodwasidentifiedbytheinductionofEAEinC57BL/6micewithstableperformanceandhighincidence,whichmaybehelpfulinexploringthemechanismandtherapyofMultiplesclerosis(MS).KeyWords:Myelinoligodendrocyteglycoprotein(MOG),Experimentalautoimmuneencephalomyelitis(EAE),Mousemodels,Pathologicalchanges目录TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"引言 1一、 材料和方法.・.・・・.・.・・.・.・.・・.・・・.・.・・.・.・.・・.・・・.・.・・.・.・.・・.・・・.・.・・.・.・.・・.・・・.・.・・.・.・.・・.・・・.・.・・.・.・.・・.・・・.・.・・.・.・.・・.・・・.・.・・.・.・.・・.・・・.・.・・.・.・.・・.・・・.・.2\o"CurrentDocument"试剂和仪器 21.1.主要试剂U 21.2主要仪器 2\o"CurrentDocument"实验动物 22.1小鼠来源 22.2饲养 3\o"CurrentDocument"EAE小鼠模型的制备 3\o"CurrentDocument"神经功能评分 3\o"CurrentDocument"脊髓组织病理学检测取材 3\o"CurrentDocument"溶液的配制 3\o"CurrentDocument"H&E、LFB染色 4H&E染色 4LFB染色 4\o"CurrentDocument"数据分析及统计学处理 5二、 实验结果与分析 5\o"CurrentDocument"1.临床评分 5\o"CurrentDocument"2病理学检测结果 6H&E结果 6LFB的结果 7\o"CurrentDocument"三、 讨论 8参考文献 10\o"CurrentDocument"致谢 12引言实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE)是研究多发性硬化(multiplesclerosis,MS)的经典动物模型，是由同种型、同种异型、异种型神经组织抗原诱导的中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)白质免疫炎性脱髓鞘性模型。其病理特征和MS相似，均表现为CNS白质脱髓鞘改变和炎性细胞浸润。制备EAE动物模型的方法多种多样，可通过注射CNS髓鞘、特定的髓鞘蛋白或其选择肽段加完全弗氏佐剂主动诱导；或转移已致敏的CD4+T细胞进行过继免疫诱导。诱导EAE由于不同的致敏原，动物品系或诱导方法可以诱导产生不同类型或不同程度的EAE，所以制备EAE动物模型的方法多种多样。目前报道较多的EAE模型动物是Lewis大鼠、SJL/J小鼠、B10.PL小鼠和PL/J小鼠等。但国内不易获得这些啮齿类动物，因而在制作EAE动物模型时均不作为首选。C57BL/6小鼠也是具EAE敏感特性的品系之一，其对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的敏感抗原表位是35~55位氨基酸。MOG35~55抗原肽含21个氨基酸，分子量为2582.4道尔顿，是唯一既能引起脱髓鞘抗体反应又能引起T细胞反应的中枢神经系统髓鞘蛋白成分。虽然MOG在髓鞘蛋白中含量很少，但由于它存在于髓鞘膜和少突胶质细胞的最外层，故具有高度免疫原性。近年来用MOG诱导的EAE逐渐成为国际上研究MS的主要模型。参照国内外文献报道的方法，结合本实验室的条件加以改进，拟采用mog35~55作为抗原，辅以腹腔注射百日咳毒素，以期成功构建C57BL/6小鼠EAE模型，来验证其免疫原性；并采用双盲法进行神经功能评分，利用电镜观察EAE小鼠的病理学变化，分别采用HE染色、LuxolFastBlue髓鞘染色法评估脊髓中炎性细胞的浸润及髓鞘脱失的情况。一、材料和方法试剂和仪器1.1.主要试剂MOG3555多肽MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK由本实验室合成，合成纯度HPLC>95%,完全弗氏佐剂（CFA,Chodrex），百日咳毒素（Pertussistoxin,Sigma），结晶紫Cresylviole（Sigma），碳酸锂（上海华硕精细化学品有限公司），坚牢兰Luxol-fast-blue（AlfaAesar），伊红Y（kermel），PBS缓冲液（0.01M，PH7.4），苏木素（郑州派尼化学试剂厂），多聚赖氨酸（Sigma），多聚甲醛（Kermel），无水乙醇，甘油。其它试剂均为国产分析纯。1.2主要仪器TDL80-2B离心机（Anke），超净工作台（苏州净化设备有限公司），电子天平（Sartorius），微量移液器（德国Eppendorf公司），4°C冰箱（Siemens），微波炉（海尔），冰盒，2ml、5ml玻璃注射器（上海鸽牌玻璃厂），医用一次性三通管（德国贝朗医疗股份有限公司），OlympusBX51荧光显微镜（日本Olympus公司），Leica石蜡切片机（Leica，RM2145），手术器械（眼科剪、眼科镊、手术刀等）。实验动物2.1小鼠来源健康6~8周龄的雌性野生型C57BL/6（H-2b）小鼠（SPF级）共16只。体重16~18g，购自中国医学科学院血液学研究所实验动物中心，许可证号：SCXK（津）2004-0001。正常组:8只，不作任何处理，EAE病理模型组8只，诱导EAE模型。2.2饲养在XX大学生物工程系SPF级动物房中饲养、繁殖，幼鼠至八周龄后进行实验。EAE小鼠模型的制备C57BL/6小鼠随机分为EAE组和正常组，各8只。MOG’^多肽用PBS稀释后与完全弗式佐剂（结核杆菌的终浓度为4mg/ml）按等体积混合，用注射器反复推拉成油包水的乳剂，每只小鼠注射0.2ml乳剂，其中MOG35~55多肽剂量为300^g/只，分别于鼠背部两侧皮下注射；在第1次免疫后0小时和48小时腹腔注射百日咳毒素稀释液0.1ml，200ng/只。正常组不做任何处理。神经功能评分自免疫当天开始，每日称体质量，观察小鼠的摄食情况，并从初次免疫第0天起至第31天实验终止前，采用盲法，每天2人至少1次在同一时间按Benson评分标准，对EAE严重性进行临床评估，评分N2分以上者（包括2分）进行发病率的计算。1级：尾部无力或蹒跚步态伴尾部有力；2级：蹒跚步态伴尾部无力（共济失调）；2.5级：共济失调伴部分单肢麻痹；3级：单肢完全麻痹；3.5级：单肢完全麻痹伴另一肢体部分麻痹；4级：双肢完全麻痹；4.5级：四肢麻痹；5级：死亡。脊髓组织病理学检测取材在EAE模型发病的高峰期，将小鼠脱颈处死，迅速取其脊髓，置于4%的多聚甲醛中固定，0.1mol/lPBS24小时、70%酒精30分钟、95%酒精I60分钟、95%酒精II60分钟、100%酒精I60分钟、100%酒精II60分钟、60°C二甲苯I60分钟、60°C二甲苯II60分钟、60°C石蜡I60分钟、60°C石蜡II60分钟后包埋。将石蜡包块用切片机连续切成3~4um切片，分别作H&E染色、LFB髓鞘染色。溶液的配制Harris苏木精的配制：苏示精1g、硫酸铝钾15g、无水乙醇10ml、蒸馏水200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1分钟后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g。继续加热至浆夜变为紫红色。用纱布盖瓶口，用前滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。6.2乙醇性伊红液Y的配制：伊红Y0.5g、90%酒精100ml先将伊红溶于酒精，用玻棒研碎溶解后，每100ml加冰醋酸1滴。6.3盐酸酒精分化液的配制：浓盐酸0.5~1ml、75%酒精99ml。LFB的配制：LFB1.0g、95%酒精100ml、10%冰醋酸5.0ml混匀、过滤。0.05%碳酸锂的配制：碳酸锂0.5g、双蒸水1000ml。0.25%Cresylviole结晶紫的配制：结晶紫0.25g、双蒸水100ml、10%冰醋酸1.0ml混匀、过滤。H&E、LFB染色H&E染色使用切片机将小鼠脊髓蜡块切为3-4^m厚，用毛笔小心将其放入45°C水浴锅中展片，并用涂抹过蛋白甘油的载玻片将其捞出，置于,60C烘箱中烘干（3小时）；将切片依次直接放入有500ml的100%二甲苯的两个染缸中，各5分钟；之后再将切片依次放入有500ml的95%酒精的两个染缸中，各2分钟；结束后再将切片依次放入有500ml的80%酒精的染缸中，染色1分钟；之后将其置入蒸馏水中，浸泡1分钟；取出后置入有500ml的Harris苏木素的染缸中，染色5分钟；取出切片，快速用流水冲去多余Harris苏木素液（3s）°8,将切片快速依次置入有500ml的1%盐酸乙醇的两个染缸中，各分化2秒，并用流水冲去多余染液，20分钟；用蒸馏水冲一下，立即置入有500mml的伊红的染缸中，染色2min；用蒸馏水快速冲一下，2秒，之后依次过80%酒精，2秒，95%酒精3秒，95%酒精5秒，100%酒精两次，各5分钟，二甲苯两次，各3分钟；取出切片，自然晾干，之后滴加适量的中性树脂封片，并用显微镜观察和摄像。LFB染色使用切片机将小鼠脊髓蜡块切为3-4^m厚，用毛笔小心将其放入45C水浴锅中展片，并用涂抹过蛋白甘油的载玻片将其捞出，置于60C烘箱中烘干（3小时）；将切片依次直接放入有500ml的100%二甲苯的两个染缸中，各7分钟;之后再将切片依次放入有500ml的100%酒精的两个染缸中，各2.5分钟；结束后再将切片依次放入有500ml的95%酒精的三个染缸中，各2.5分钟；再将切片置入有500ml的LFB染液的染缸中，置于60°C水浴锅中20分钟，避光放置；时间到时取出切片，用95%酒精小心冲洗掉组织及玻片上的多余染液，之后用蒸馏水浸泡20分钟，使冲洗更干净；将切片置入有500ml的0.05%碳酸锂的染缸中，15秒；立即取出切片，依次置入有500ml的70%酒精的两个染缸中分色15秒，之后用蒸馏水冲洗干净，并用显微镜观察，直至脊髓白质与灰质有鲜明的对比，核为无色，髓鞘在浅灰或是浅蓝色背景下为绿色，如不是，则重复7,8两个步骤；合格后，再次将切片置入有500ml的70%酒精的染缸中分色15秒；立即取出并置入有500ml的醇性伊红的染缸中，染色30秒，之后用蒸馏水冲洗干净，并浸泡10分钟；11之后将切片置入有500ml的结晶紫的染缸中，染色1分钟，之后用蒸馏水冲洗干净，并浸泡10分钟；12依次快速的将切片浸入有500ml的95%酒精，以及有500ml的100%酒精的两个染缸中，各5秒；13再次依次将切片浸入有500ml的二甲苯的三个染缸中，各4分钟；14取出切片，自然晾干，之后滴加适量的中性树脂封片，并用显微镜观察和摄像。数据分析及统计学处理采用SPSS12.0统计软件。组间比较用t检验。PW0.05，差异有统计学意义。二、实验结果与分析1.临床评分EAE组8只小鼠从免疫后第15天开始陆续发病，大约在第21天达到发病高峰，发病率为100%。发病后EAE组小鼠的一般状况较正常对照组差，表现为食欲降低、体质量减轻、皮毛不光滑、活动量减少。同时EAE组小鼠相继出现神经系统症状，表现为尾部无力拖垂表现为尾部无力脱垂、步履蹒跚、后肢瘫痪、行动困难，进而发展为四肢瘫痪，最高评分为4分（见图2）。正常对照组小鼠未出现临床神经系统症状，体质量持续增加（见图1），神经功能评分为0分。两组小鼠临床症状打分比较，见图3,组间p<0.01。EAE组症状显著，与正常对照组小鼠相比，具有显著的统计学差异。图2双后肢瘫痪（4分）图1对照组鼠图2双后肢瘫痪（4分）图1对照组鼠图3小鼠神经功能评分2病理学检测结果2.1H&E结果EAE组小鼠的脊髓白质和灰质中均有炎性细胞浸润，但病变分布以脊髓颈腰膨大为主（见图4B，箭头所示），表现为大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润，浸润沿包膜和小血管由外向内延伸。正常对照组小鼠脊髓中未见异常改变（见图4A）。

（A） （B）图4H&E染色结果注：（A）：为正常的小鼠脊髓切片。（10X20）；（B）：为病变的小鼠脊髓切片，箭头示炎性细胞侵润（10X20）LFB的结果可见EAE组小鼠的脊髓有大小不等的片状脱髓鞘区，并形成“空泡”。炎性细胞浸润弥散，灰白质受累，尤以灰白质交界区最重，前索及侧索内均有片状脱髓鞘区（见图5B,箭头所示）。正常对照组小鼠脊髓中未见异常改变（见图5A）。(A)(B)(A)(B)(C) (D)图5LFB染色结果注：(^(0：为正常的小鼠脊髓切片°(10X20)；(B)(D)：为病变的小鼠脊髓切片，箭头示炎性细胞侵润和髓鞘脱落形

成“空泡”(10X20)三、讨论从鸟类到哺乳动物的多种动物均可成功诱发EAE模型，但不同品系的动物敏感性有很大不同。对MOG35~55敏感的动物有：Lewis,DA大鼠和C57BL/6(H-2b)，鉴于对EAE敏感的Lewis和DA大鼠，价格昂贵、不易获得。C57BL/6(H-2b)小鼠对诱发EAE相当敏感，且品系纯正，遗传背景知识全面、丰富，遗传学、免疫学等的研究也较深入，因此小鼠更适用于有关基因、细胞间相互作用和发病机制等领域的研究。用小鼠MOG35~55多肽免疫C57BL/6小鼠，产生的EAE慢性一非缓解性EAE，其症状与人类MS很相似，表现为脊髓、大脑和视神经的炎症和髓鞘脱失。虽然MOG在髓鞘蛋白中含量很少，但由于它存在于髓鞘膜和少突胶质细胞的最外层，故具有高度免疫原性。近年来用MOG诱导的EAE逐渐成为国际上研究MS的主要模型。固相合成是多肽合成领域的一个重大突破，在合成多肽中具有快速、简便、高效等优点，因此，本实验室研究人员利用改进后的Fmoc固相合成法，合成MOG35~55多肽，经RP-HPLC纯化后，合成的MOG35~55纯度可达95%，精肽产率达到13.58%。本研究中选用的实验动物C57BL/6纯系小鼠在国内的来源较为广泛，而且MOG多肽的结构明确，并可精确定量，在此基础上建立的EAE模型更适合从分子免疫学的角度探讨EAE的发病机制。特别值得注意的是，本研究以合成的MOG~抗原肽制备C57BL/6小鼠EAE模型发病率达到100%,对后续在某些免疫调节相关基因突变型小鼠中制备EAE模型，研究这些基因在疾病进程中的作用和设计成为药靶的可能性打下了良好基础。总之，通过对C57BL/6小鼠EAE模型行为学和病理学的检测，验证了MOG’^抗原肽的免疫原性。即本实验室采用改进的Fmoc固相合成法，可获得具有良好免疫原性的MOG3555抗原肽，用以制备的C57BL/6小鼠EAE模型稳定可靠、发病率高，可为进一步研究MS免疫学发病机制提供帮助。参考文献.JuedesAE,HjelmstromP,BergmanCM,etal.KineticsandCellularOriginofCytokinesintheCentralNercousSystem:InsightintoMechanismsofMyelinOligodendrocyteGlycoprotein-InducedExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis.JImmunol,2000,16.4(1):419-426..邢清和，王永铭，郑荣远.影响EAE动物模型建立的因素分析.中国临床神经科学.2000，8(4)：305-306..魏岗之，袁锦楣，张津等.神经系统脱髓鞘性疾病.第一版.北京.人民军医出版社,2003,50-51..穆阳.不同剂量MOG抗原免疫诱导小鼠自身免疫性脑脊髓炎模型的比较.中国实验动物学报2010,18..王超.多发性硬化的T细胞研究进展.中国神经免疫学和神经病学杂志.2009.16..邢清和.2000.影响EAE动物模型建立的因素分析.中国临床神经科学8..CostaO,DivouxD,IschenkoA,etal.OptimizationofananimalmodelofexperimentalautoimmuneencephalomyelitisachievedwithamultipleM()G55peptideinC57BL6/Jstrainofmice[J].JAutoimmun,2003,20(1):51-61..HanX,GuJ.ApplicationofSolid-phasePeptidesSynthesis[J].ProgressinPharmaceuticalSciences,2004,28(1