引物设计实例分析课件

引物设计实例分析引物设计实例分析1引物设计基本原则引物长度（primerlength）产物长度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)G+C含量（composition）引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin）阅读框引物设计基本原则引物长度（primerlength）21.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度1.引物的长度一般为15-30bp，常用的32.产物的长度扩增片段长度为100~600碱基对.2.产物的长度扩增片段长度为100~600碱基对.43.Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度.如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G)3.Tm值引物的Tm值一般控制在55-654.引物的GC含量

有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。4.引物的GC含量

有效引物中(G+65.引物自身

引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败5.引物自身71.打开软件，调入序列

1.打开软件，调入序列82、选择路径，选择序列文件名，加入右框

2、选择路径，选择序列文件名，加入右框93、序列文件显示如图，点击“primer”；

4.按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击“确定”进行引物搜寻

3、序列文件显示如图，点击“primer”；4.按照引物105、等待引物搜寻，显示结束后，点击“确定”。5、等待引物搜寻，显示结束后，点击“确定”。116、按照搜寻结果显示，逐条分析，在主窗口中检查该引物对的二级结构情况，依次筛选

6、按照搜寻结果显示，逐条分析，在主窗口中检查该引物对的二级12PrimerPremier5的引物评价窗口PrimerPremier5的引物评价窗口13任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1任务14SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFPSPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid1:P15SPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFPSPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aG16121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcgggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

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NR1的编码序列(~4000bp)红色为信号肽,蓝色为BamHI酶切位点,下划线标出酶切位点的阅读框NR1的编码序列(~4000bp)红色为信号肽,蓝色为Ba17ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGFP序列(~700bp)GFP序列(~700bp)18引物要求PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变引物要求PCR扩增GFP195’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’3’TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’GFP序列5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’

3’TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………CGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………………..AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer2Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….第一步：扩增GFP基本序列变性,引物复性GFP序列3’TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG20第二步：GC比值；Tm值Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）第二步：GC比值；Tm值Primer1:5’ATG21第三步：酶切位点Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）BamHI:ggatccPrimer1:5’ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5’ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC第三步：酶切位点Primer1:5’ATGGTGA22第四步：阅读框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

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cgcgcggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacctNR1序列：5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’

GFP序列cgcgcg

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