牙本质特异性蛋白与生物矿化课件

生物矿化

Biomineralization机体矿化组织在生物调控下由特殊细胞分泌有机基质，基质中蛋白质诱导钙、磷离子在基质上并按特定空间结构和时间顺序形成晶体并生长，这个过程称“生物矿化”。生物调控——基因调控、细胞因子介导生物矿化

Biomineraliz1牙齿硬组织、骨生物矿化发育规律发育缺陷修复机制牙齿再生活髓保存牙周组织损伤修复牙齿硬组织、骨发育规律发育缺陷修复机制牙齿再生活髓保存2牙本质有机物蛋白质蛋白多糖、脂类、枸橼酸盐等胶原—-I型为主（少量ⅢⅤⅠ型三聚体）Collagen……86%非胶原蛋白…………..10%（noncollagenousproteinsNCPs)牙本质有机物蛋白质蛋白多糖、脂类、枸橼酸盐等胶原—-I型3牙本质非胶原蛋白NCPs牙本质特异性蛋白矿化组织特异性蛋白多组织非特异性蛋白血清来源蛋白牙本质磷蛋白（DPP）牙本质涎蛋白（DSP）牙本质涎磷蛋白（DSPP）牙本质基质蛋白（DMP1）骨钙素（OC）骨涎蛋白（BSP）骨桥素（OPN）纤维粘连蛋白（FN）糖蛋白（FG）IgG、白蛋白牙本质非胶原蛋白NCPs牙本质特异性蛋白矿化组织特异性蛋白多4牙本质特异性蛋白与生物矿化课件5DPP的发现和定义Veis和Penny(1967)发现高度磷酸化的含丝氨酸（Ser)，天门冬氨酸（Asp)的酸性蛋白。占非胶原蛋白的50%。牙本质磷蛋白

DentinPhosphoprotein,DPP

DentinPhosphophoryn,DPPDPP的发现和定义牙本质磷蛋6

DPP的合成、分泌和分布Veinstock等用3H、33P标记丝氨酸，磷酸根（小鼠）

Munksguard等在牙髓细胞的培养加入3H—丝氨酸、33P—磷酸根

Rabie等用胶体金抗体标记前成釉细胞成牙本质细胞矿化前沿前期牙本质合成高尔基体运输胶原DPP分泌小泡内质网DPP的合成、分泌和分布前成釉细胞矿化前沿前期牙本质合成7DPP提取DPP的生物学特性（1）亲水性、强酸性、等电点1.1（2）含磷量高：5.9%（3）分子量：范围大，种属间有差异大鼠30-100KD，小鼠72KD牛35-158KD，人140KD左右DPP提取8（4）氨基酸组成人、牛、鼠的氨基酸组成（4）氨基酸组成人、牛、鼠的氨基酸组成9（5）氨基酸序列及分子结构1996年Crossley等在IADR上报告，牛DPP氨基酸序列：Asp-Pse-Pro-Asn-Pse-Pse[Asp-(Pse)n]x,n=1-3,X为未知数最近George(1998)报告大鼠切牙DPPC末端有（DSS)n、(SD)m重复结构，磷酸化有结合Ca2+能力，n≥3与Ca2+结合能力强

（5）氨基酸序列及分子结构10目前已了解大鼠、小鼠、牛、人的氨基末端序列和功能片段。1998年Gu等用RT-PCR技术克隆了人DPPcDNA，经分析与人牙根分离出的DPPN端序列相符。MacDougall等从小鼠牙本质DNA克隆获得DPP-DSP复合物。目前已了解大鼠、小鼠、牛、人的氨基末端序列和功能片段。11DPP的功能（1）DPP诱导和促进生物矿化的作用DPP与Ca2+有强的结合能力具有与Ca2+结合的高亲和力位点(Ser磷酸化）结合Ca2+的能力：一个PO43-结合1.5个Ca2+127和176molCa2+/molDPP结合Ca2+能力与DPP结构特点有关（George1998)(DSS)n和（SD）m磷酸根、羧酸根位置。牙本质特异性蛋白与生物矿化课件12

DPP诱导调节HAP晶体形成DPP与胶原结合，改变立体化学结构，HAP晶体成核作用。Lussi(1998)Hunter(1996)证明DPP结合到HAP晶体的特殊平面，调节晶体大小DPP对胶原的作用

DPP对牙本质矿化作用DPP分布矿化前沿DPP种植诱导牙本质形成Lussi和Linda(1993),VandenBos(1994)DPP诱导调节HAP晶体形成13(2)DPP抑制生物矿化作用Lussi等研究：DPP浓度>40ug/ml抑制HAP晶体形成，DPP浓度>160ug/ml晶体形成完全被抑制。Clarkson等：可溶性DPP有一定的抑制牙本质再矿化作用。(2)DPP抑制生物矿化作用14人DPP提取人DPP生物学特性人DPP生物学作用人牙本质磷蛋白的研究——北京市自然科学基金项目人DPP提取人牙本质磷蛋白的研究——北京市自然科学基金项15人DPP分离纯化

-70℃,15%NaCL健康离体牙刮除软组织粉碎

蛋白抑制剂(PI)（约50目）

2.56MNaCL+PI

SDS处理

清洗备用

4℃牙本质粉沫的制备人DPP分离纯化牙本质粉沫的制备16

脱矿

2000ml0.6NHCl3周2天换一次

牙本质粉+0.6NHCl(约1ml/g)浓缩离心取上清测钙浓度至微量粗提DPP

装入透析袋脱矿——粗提牙本质粉浓缩离心取测钙浓度至微量粗提DPP装入17DEAE-SepharoseCL6B

离子交换层析粗提DPP

层析

4℃0～0.7MNaCl梯度洗脱

紫外检测仪，230nm，检测蛋白等离子发射光谱检测磷含量纯化DPP

样品

分离纯化DEAE-SepharoseC18

蛋白含量分析磷含量分析分子量测定氨基酸组成分析DPP的特性分析蛋白含量分析DPP的特性分析19蛋白含量分析图1.DPP洗脱曲线图蛋白含量分析图1.DPP洗脱曲线图20磷含量分析图2.DPP磷含量曲线(ppm)磷含量分析图2.DPP磷含量曲线(ppm)21

把蛋白质吸光曲线和磷含量曲线绘于同一坐标内，可以得到如下曲线图图3.DPP蛋白含量与磷含量曲线分析图252015105磷含量(ppm)把蛋白质吸光曲线和磷含量曲线绘于同一坐标内，可以得22

DPP分子量测定141kD124kD108kDSDS电泳图谱HCL脱矿：141KD、124KD、108KDDPP分子量测定141kD124kD108kDSDS电泳图23

DPP氨基酸分析Met 8.1Ile 25.6Leu 25.8Tyr 8.9Phe 8.6Lys 36.4His 9.8Arg 26.9注：均为每1000个氨基酸残基中的值氨基酸 AA数目Asp 238.1Thr 30.2Ser 191.5Glu 174.4Pro 41.2Gly 103.0Ala 36.9Val 34.6所提DPP样品的氨基酸分析结果如下表：DPP氨基酸分析Met 8.1氨基酸 AA数目所提DPP样24本研究结果与国外学者基本一致，说明富含天门冬氨酸、丝氨酸的人DPP，含磷量高，具有与钙结合，诱导生物矿化的分子基础。本研究结果与国外学者基本一致，说明富含天门冬氨酸、丝25DPPBSA空白EAH-Sepharose4B矿化液37℃48h[Ca2+]/[PO43-]=1.67DPP在体外诱导生物矿化作用DPPBSA空白EAH-Sepharose4B矿化液[Ca26BSADPP对照BSADPP对照27X衍射分析结果说明磷酸钙HAPCa5(PO4)3OHCa3(PO4)2CaHPO4Ca8H2(PO4)6·5H2OX衍射分析结果说明磷酸钙Ca5(PO4)3OH28钙磷含量的测定

测定各150mg凝胶颗粒的表面Ca、P沉积量结论：人DPP与一定的支持物结合可启动HAP成核诱导矿化。钙磷含量的测定

测定各150mg凝胶颗粒的表面Ca、P沉积量29实验动物：小型猪一周龄14-20Kg，选实验牙—第一恒磨牙20颗，下颌切牙10颗,牙随机分组，DPP盖髓，观察2周、1月、3月结果：处死动物，实验牙切片HE染色结论：DPP对牙髓损伤的修复过程比氢氧化钙更快诱导修复性牙本质形成。DPP对培养的人牙髓细胞的作用DPP促进生物矿化的动物实验实验动物：小型猪一周龄14-20Kg，选实验牙—第一恒磨30人牙本质磷蛋白促进牙髓创伤修复人牙本质磷蛋白促进牙髓创伤修复31人牙本质粉制备乙酸脱矿上清液A上清液B离子交换层析可溶性DPP再矿化实验特性检测测定P含量蛋白含量1MNaCL处理牙本质磷蛋白对再矿化的抑制作用人牙本质粉制备乙酸脱矿上清液A上清液B离子交换层析可溶性DP32结果上清液A、B中的总蛋白浓度结果上清液A、B中的总蛋白浓度33证明：1MNaCL提取可溶性DPP证明：1MNaCL提取可溶性DPP34再矿化实验牙根磨片实验组对照组再矿化液处理1MNaCL处理脱矿钙离子测定SEM观察MRG照片吸光度测定再矿化实验牙根磨片实验组对照组再矿化液处理1MNaCL处理35再矿化液中钙含量测定T检验P<0.01再矿化液中钙含量测定T检验P<0.0136扫描电镜观察实验组对照组扫描电镜观察实验组对照组37显微放射照片的平均吸光度检验

DPP抑制生物矿化的可能机制可溶性（游离性）DPP的作用显微放射照片的平均吸光度检验DPP抑制生物矿化的可能机制38目的：利用分子生物学技术克隆和表达包含功能区的人DPP片段，以便通过人DPP功能片段研究促进牙齿生物矿化（发育和修复功能）作用的研究。人牙本质磷蛋白基因片段的克隆和表达目的：人牙本质磷蛋白基因片段的克隆和表达39人DPP基因全序列的亚克隆及其5’端序列的克隆分析通过酶切分析和DNA序列测定，证实DPP重组质粒（pBlueBacHis2-DPP)带有人DPP基因。通过基因亚克隆建立了带有人DPP基因的稳定克隆株。采用分子克隆技术构建了含人DPP基因5’端序列的重组质粒pT-DPP-N并进行测序。pT-DPP-N质粒（含DPPcDNA5’端序列）生化特性：168个氨基酸，富含天门冬氨酸和丝氨酸，含RGD序列和DSS重复序列，PI为3.115，分子量为16869.1D。人DPP基因全序列的亚克隆及其5’端序列的克隆分析4021564bp2027bp

pBluBacHis2-DPP的PCR扩增产物（人DPP基因5’端序列）Lane1：λDNA/HindIIILane2:PCR扩增产物21564bp2027bppBluBac41504bpBamHⅠEcoRI504bpBamHⅠEcoRI42Ala(A):31.77Asx(B):00Cys(C):00Asp(D):4526.62Glu(E):42.38Phe(F):00Gly(G):105.91His(H):00Ile(I):00Lys(K):74.14Leu(L):00Met(M):00Asn(N):2011.83Pro(P):1.59Gln(Q):00Arg(R):1.59Ser(S):7443.78

Thr(T):21.18Val(V):00Trp(W):00Unk(X):00Tyr(Y):1.59Glx(Z):00Total:168100人DPP蛋白N端氨基酸组成人DPP蛋白Asp(D):26%Ser(S):58%Ala(A):31.77A43人DPP5’端序列的表达和纯化构建带有人DPP基因5’端序列GST融合蛋白表达质粒（p5X-1-hDPP-N)，并在原核表达系统中进行表达纯化。504bpBamHⅠEcoRILane1:DL2000Lane2:p5X-HDPP-N酶切电泳21100bp250bp500bp750bp1500bp2000bp人DPP5’端序列的表达和纯化504bpBamHⅠEcoRI44构建带有人DPP基因5’端序列的杆状病毒表达质粒（pFASTBAC-hDPP-N)，并在真核（sf9细胞）中表达了人DPP基因5’端序列片段。

Lane1:超声后的沉淀

Lane2:超声后的上清

Lane3:中分子量Marker12396KDa66KDa43KDa

Lane1:蛋白复性时的析出沉淀

Lane2:GST-BSAMarkerLane3:蛋白纯化带12366KD26KD构建带有人DPP基因5’端序列的杆状病毒表达质粒（pFAST45504bp504bp真核表达质粒的构建BamHⅠEcoRIBamHⅠEcoRI504bp504bp真核表达质粒的构建BamHⅠEcoRIB46A上：正常sf9细胞培养24小时A下：正常sf9细胞培养48小时B上：病毒感染细胞24小时B下：病毒感染细胞48小时

AB

1:2代毒细胞总蛋白2：3代毒细胞总蛋白1220kD31kD14KDA上：正常sf9细胞培养24小时A47Vies等（1994）筛选鼠切牙成牙本质细胞和牙本质cDNA文库时发现一种与BSP的氨基酸组成相似的新蛋白称DSP。鼠DSP占牙本质非胶原蛋白的5%~8%，含糖30%，其中10%为涎酸。DSP主要氨基酸是天门冬、丝、甘、谷氨酸，有13个潜在的磷酸化位点，6个N-糖基化的位点。鼠DSP基因编码383个氨基酸（17-信号肽，366—分泌DSP）

牙本质涎蛋白

DentinSialoproteinDSPVies等（1994）筛选鼠切牙成牙本质细胞和牙本质cDNA48DSP生物学作用可能参与牙本质生物矿化的启动晶体形成。并促进HAP晶体生长。可能参与牙胚发育期上皮与间叶组织之间信号传递，互相调控。DSP生物学作用49MacDougall等（1997）发现：小鼠牙的DPP与DSP是一条目的基因编码的蛋白质。DSPPcDNA中信号肽及N端序列有75%与DSP一致，C端的489个氨基酸编码与DPP一致。DSPP为酸性蛋白（PI=4.0），富含天门冬氨基酸（18.9%），丝氨酸（36.3%）DSPP基因位于人类染色体4q21~23.牙本质涎磷蛋白

DentinSialophosphoprotein,DSPPMacDougall等（1997）发现：小鼠牙的DPP与DS50DSPP与DPP、DSP的关系信号肽——DSP-----------DPP基因碱基顺序1-135136-12461439-2905氨基酸顺序1-1718-387452-940（17）（370）（489）Gu.K等（2000）克隆了人DSPP基因，证实与小鼠有同源性。cDNA=4420kb,940个氨基酸。1-4外显子编码DSP5外显子编码DSP的C端和DPP全长。连接区MPLPDSPP与DPP、DSP的关系信号肽——DSP---51DSPP的生物学作用与牙齿发育中，上皮—间叶细胞的相互调控作用有关。促进生物矿化及牙髓创伤的修复DSPP基因突变，影响DSPP基因功能，导致牙本质发育不全（DGI-II）DSPP的生物学作用与牙齿发育中，上皮—间叶细胞的相互调52——牙本质发育不全II型（dentinogenesisimperfectaDGI-IIshieldstypeII)发病可能原因：DSPP基因外显子2或3的DSP区出现突变点，核苷酸易位，导致跨膜氨基酸改变。部分DSP和DPP全部表达缺失矿化障碍。定位4q21.DSPP与遗传性乳光牙本质

Opalescentdentin——牙本质发育不全II型（dentinogenesisim53牙本质形成和矿化是多因素参与的复杂过程。牙本质特异性蛋白是诱导牙本质矿化最重要的蛋白质，也是成牙本质细胞标志物。目前研究的热点。

牙本质涎磷蛋白在小鼠牙胚发育中的表达。牙本质涎磷蛋白反义核酸体外培养牙胚矿化的影响。