基因工程制药

基因工程制药第1页，课件共106页，创作于2023年2月基因工程药物是应用基因工程和蛋白质工程技术制造的重组活性蛋白、多肽及其修饰物治疗蛋白、抗体、疫苗、连接蛋白和可溶性受体等第2页，课件共106页，创作于2023年2月主要基因工程产品的研制、开发、上市时间产品人生长激素释放抑制素（SRM)人胰岛素首次克隆表达时间国家用途首次进入市场时间国家/地区1977日本治疗巨人症1978美国治疗糖尿病1982欧洲人生长激素（HGH)1979美国治疗侏儒症1985美国人α干扰素（α－IFN)1980美国治疗病毒感染症1985美国乙肝疫苗1983美国预防乙型肝炎1986欧洲人白细胞介素－21984日本治疗肿瘤1989欧洲人促红细胞生成素治疗贫血1988欧洲人粒细胞集落刺激因子治疗中性白细胞减少症1991美国人组织纤溶酶原激活剂（t-PA)治疗血栓症1987美国第3页，课件共106页，创作于2023年2月第一节基因工程药物生产的基本过程第4页，课件共106页，创作于2023年2月DNA重组药物制造的主要步骤获得目的基因DNA的体外重组（切与连）载体的选择受体细胞的选择重组DNA分子转化（转）转化子的筛选与鉴定（选）外源基因的大规模表达和分离纯化产品的检验和制剂制备第5页，课件共106页，创作于2023年2月基因工程制药过程上游部分下游部分第6页，课件共106页，创作于2023年2月上游主要程序目的基因的获得和克隆重组载体的构建重组载体转入宿主细胞外源基因在宿中细胞中的表达表达产物的检测第7页，课件共106页，创作于2023年2月第8页，课件共106页，创作于2023年2月下游主要程序工程菌的发酵目的蛋白的分离纯化逐步加工成药品

第9页，课件共106页，创作于2023年2月第10页，课件共106页，创作于2023年2月第二节基因工程基本原理第11页，课件共106页，创作于2023年2月一、常用工具酶限制性内切酶DNA连接酶DNA聚合酶逆转录酶第12页，课件共106页，创作于2023年2月限制性内切酶

内切酶有I、II、III型三种类型，基因工程用II型内切酶II型内切酶其特点有：能专一性地识别特异性的序列，如BamHI，识别特异序列G^GATCC；识别序列一般都有回文结构；切割后的DNA序列是平末端或粘末端第13页，课件共106页，创作于2023年2月第14页，课件共106页，创作于2023年2月第15页，课件共106页，创作于2023年2月第16页，课件共106页，创作于2023年2月DNA连接酶

DNA连接酶可以在体外将不同来源的DNA片段，连接起来成为新的杂种DNA分子，常用的连接酶有T4噬菌体连接酶和大肠杆菌连接酶第17页，课件共106页，创作于2023年2月第18页，课件共106页，创作于2023年2月DNA聚合酶

DNA聚合酶是能催化DNA复制和DNA分子损伤的酶类，基因工程中常用的聚合酶是耐热的聚合酶，如Taq酶，此酶最佳的活性温度是75－80℃第19页，课件共106页，创作于2023年2月逆转录酶

是依赖于RNA为模板的DNA聚合酶，同时有RNA酶H的活性常用的逆转录酶有鼠源的和禽源的两种第20页，课件共106页，创作于2023年2月二、PCR技术PCR反应是聚合酶链式反应，常用的PCR技术是普通的PCR和逆转录PCR第21页，课件共106页，创作于2023年2月(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的扩增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互补链引物1互补链单位长度的链不同长度的链5’3’3’5’引物1互补链引物2互补链目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图(e)(f)(g)第22页，课件共106页，创作于2023年2月三、常用的载体克隆载体表达载体第23页，课件共106页，创作于2023年2月第三节常用表达系统第24页，课件共106页，创作于2023年2月一、大肠杆菌表达系统有自主复制起点筛选标记启动子，能被RNA聚合酶识别终止子翻译起始信号多克隆位点第25页，课件共106页，创作于2023年2月pBV220系统pET系统第26页，课件共106页，创作于2023年2月pBV220质粒菌株DH10BJM109DH5α第27页，课件共106页，创作于2023年2月pET质粒菌株BL21DE3第28页，课件共106页，创作于2023年2月二、酵母表达系统原核复制起始位点原核筛选标记及其转录和表达元件，包括启动子、终止子、翻译起始信号多克隆位点真核转录和表达元件，包括启动子、终止字、翻译起始信号真核复制起始位点或整合位点真核筛选标记第29页，课件共106页，创作于2023年2月

啤酒酵母表达系统毕赤酵母表达系统裂殖酵母表达系统汉逊酵母表达系统第30页，课件共106页，创作于2023年2月Invitrogen公司的pYES2质粒，含2μ复制序列和pUC复制起点，Amp和Ura筛选标记，GAL1启动子和CYC2终止子pPIC9K全长9.3Kb，原核有氨苄和卡那抗性，真核中是组氨酸和HG418筛选标记，有和染色体重组的整合位点，在多克隆位点的上游有信号肽序列，用甲醇诱导表达第31页，课件共106页，创作于2023年2月pYES2半乳糖激酶启动子第32页，课件共106页，创作于2023年2月pPIC9K甲醇氧化酶启动子目前已发现的、最强的真核启动子

第33页，课件共106页，创作于2023年2月第四节基因工程制药上游技术第34页，课件共106页，创作于2023年2月一、目的基因的获得1.化学合成法在核酸合成以上可以自动合成一条单链的寡聚核苷酸，准确率比较高，但是费用也高稍微长一点的基因，可以用互为引物PCR方法获得再长一点的基因，可以用几个粘末端的双链片段通过连接酶连接组装而成第35页，课件共106页，创作于2023年2月2.PCR法如果知道基因序列，且基因没有内含子，就可以通过合成引物，通过PCR的方法人工合成基因3.逆转录法对有内含子的基因常采用的方法，具体工程为：提取细胞或组织的总RNA，用逆转录酶和OligodT合成cDNA的第一链，再通过PCR方法合成第二连第36页，课件共106页，创作于2023年2月二、目的基因的克隆

一般是将目的基因连接到T载体上，但有时候这一步可以省略

第37页，课件共106页，创作于2023年2月三、基因的体外重组

双酶切T载体和表达载体，体外连接

第38页，课件共106页，创作于2023年2月四、重组产物转入到宿主菌中

体外连接的产物，用合适的方法转入到宿主菌中，如用氯化钙或电转化法转入到大肠杆菌中，酵母的转化还要经历大肠杆菌阶段第39页，课件共106页，创作于2023年2月五、外源基因的表达

根据启动子的类型，采用不同的表达条件，如pET系统，用IPTG或乳糖诱导，pBV220系统采用温度诱导，毕赤酵母用甲醇诱导

第40页，课件共106页，创作于2023年2月六、目的蛋白的检测

一般采用活性试验和/或电泳菌体总蛋白质第41页，课件共106页，创作于2023年2月第42页，课件共106页，创作于2023年2月第43页，课件共106页，创作于2023年2月第五节

基因工程制药上游过程实例

第44页，课件共106页，创作于2023年2月实例一

三段引物，PCR扩增PCR产物连接到T载体上转化到大肠杆菌T载体双酶切

表达载体双酶切体外连接转化到大肠杆菌提取质粒转化到表达宿主菌诱导表达电泳检测蛋白第45页，课件共106页，创作于2023年2月实例二

两段引物，PCR扩增PCR产物连接到T载体上转化大肠杆菌T载体双酶切

表达载体双酶切体外连接转化大肠杆菌提取质粒转化到酵母中活性检测第46页，课件共106页，创作于2023年2月实例三

鲨鱼肝总RNAOligodT逆转录第一链鲨肝活性肽N端序列，OligodTcDNA双链连接到T载体上双酶切 T载体和表达载体体外连接两个片段转化到大肠杆菌中测序，与多肽序列对照诱导表达电泳检测分子量，活性试验第47页，课件共106页，创作于2023年2月第六节工程菌的稳定性

第48页，课件共106页，创作于2023年2月工程菌的不稳定性大多数是由于质粒不稳定造成的第49页，课件共106页，创作于2023年2月一、工程菌的稳定性质粒分裂的不稳定:工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象质粒结构的不稳定:指外源基因从质粒上丢失或者碱基重排、缺失而导致的工程菌性能的改变

第50页，课件共106页，创作于2023年2月1.质粒不稳定产生的原因含质粒菌产生不含质粒菌的比率两种菌的比生长速度差异的大小插入的外源基因影响了质粒稳定区的结构第51页，课件共106页，创作于2023年2月2.提高质粒稳定性的方法两阶段培养法发酵工艺条件的优化选择合适的宿主菌或质粒增大选择压力固定化技术第52页，课件共106页，创作于2023年2月两阶段培养法菌体生长的一定阶段的时候，进行诱导表达大肠杆菌的pET系统毕赤酵母第53页，课件共106页，创作于2023年2月发酵工艺条件的优化通过适当发酵工艺，可以提高质粒的稳定性，可以间隙改变发酵的环境参数，如温度、溶氧量、酸碱度等第54页，课件共106页，创作于2023年2月选择合适的宿主菌或质粒根据表达蛋白的性质，选择合适的宿主菌和质粒搭配pET系统中的宿主菌有BL21、DE3、DH10B等，质粒有pET－3、5、12、14、、17、21、22、25、28、32、34、40等相对而言，Kan抗性的质粒一般比Amp抗性稳定裂殖酵母的nmt1启动子，有三种不同的强度第55页，课件共106页，创作于2023年2月增大选择压力Amp的工作浓度一般在50μg/ml，发酵培养是可以加大到200μg/ml第56页，课件共106页，创作于2023年2月固定化技术将细胞固定在载体上进行培养第57页，课件共106页，创作于2023年2月第七节

重组蛋白高表达策略

第58页，课件共106页，创作于2023年2月一、大肠杆菌表达系统

1.外源基因的拷贝数2.外源基因的表达效率3.表达产物的稳定性4.细胞的代谢负荷5.发酵条件的优化第59页，课件共106页，创作于2023年2月外源基因的拷贝数一般情况下，菌体内质粒的拷贝数越多，外源基因就越多，转录的RNA也就越多，翻译出来的蛋白也就越多第60页，课件共106页，创作于2023年2月外源基因的表达效率

就目前人们的认识水平，许多因素影响外源基因的表达效率启动子核糖体结合位点SD序列起始密码子ATG的距离密码子的组成第61页，课件共106页，创作于2023年2月表达产物的稳定性

外源基因在大肠杆菌中表达，表达产物对宿主菌而言，是异物，所以大肠杆菌体内常会产生一些蛋白，消化表达产物，采用融合表达，分泌表达，点突变（改变外源蛋白的酶切识别位点），选用蛋白酶缺陷型的宿主菌第62页，课件共106页，创作于2023年2月细胞的代谢负荷

大量复制质粒和表达外源基因，会破坏宿主菌原有的代谢平衡减轻细胞代谢负荷的一个方法是菌体的生长和表达外源基因分为两个阶段第63页，课件共106页，创作于2023年2月发酵条件的优化

第64页，课件共106页，创作于2023年2月二、酵母表达系统

1.外源基因的拷贝数相对于大肠杆菌，酵母的质粒要少得多，而整合型的质粒，如毕赤酵母，由于拷贝数可以比较高，所以现在用地非常普遍2.外源基因的表达效率1）启动子2）分泌信号的效率3）终止序列的影响4）偏好密码子的使用第65页，课件共106页，创作于2023年2月3.外源蛋白的糖基化4.宿主菌的选择1）生长力强2）内源蛋白酶活性弱3）菌株性能稳定4）分泌能力强第66页，课件共106页，创作于2023年2月5.发酵条件的优化第67页，课件共106页，创作于2023年2月第八节重组蛋白的复性策略

第68页，课件共106页，创作于2023年2月包含体（包涵体）：又称光折射体，大肠杆菌高量表达外源基因时，大量的表达产物和DNA碎片、RNA、核糖体等结合在一起形成的一种颗粒包含体中的蛋白质一般是不正确折叠的蛋白，特别是二硫键的错配第69页，课件共106页，创作于2023年2月

高效表达的目的蛋白在大肠杆菌内形成大量无活性包含体。

因无法有效的解决复性问题，在美国每年造成的经济损失就达几十亿美元包含体电镜图第70页，课件共106页，创作于2023年2月一、减少包含体的策略

温度分泌表达选用合适的宿主菌和载体稀有密码子第71页，课件共106页，创作于2023年2月二、包含体的复性

包含体是不溶性物质，其中的蛋白质复性一般过程是：用盐酸胍、去污剂（Triton）等处理，是蛋白变成完全随机的结构形式，然后除去变性剂，再重新折叠成结构活性的蛋白第72页，课件共106页，创作于2023年2月包含体复性方法

溶液中复性反胶束环境复性分子伴侣固相复性第73页，课件共106页，创作于2023年2月二硫键形成的方法

空气氧化巯基化合物二硫键异构酶混合二硫键交换法第74页，课件共106页，创作于2023年2月第九节

分离纯化实例

第75页，课件共106页，创作于2023年2月1.重组类人胶原蛋白

第76页，课件共106页，创作于2023年2月胶原是结缔组织的结构蛋白胶原蛋白是在提取胶原时，结构没有改变的一类蛋白羟脯氨酸

第77页，课件共106页，创作于2023年2月第78页，课件共106页，创作于2023年2月重组类人胶原蛋白是通过逆转录在人体中钓取基因后，进行了某些位点的突变，并在大肠杆菌中表达的重组蛋白分子量70，000方法：亲和层析纯化

第79页，课件共106页，创作于2023年2月发酵后的工程菌，5000r/min离心30分钟质液比1：6将菌体悬浮于细胞破碎缓冲液中（1mmol/LEDTA,5mmol/LTris）冰水浴中超声波破碎仪间断超声十次，每次90秒第80页，课件共106页，创作于2023年2月破碎液于4℃，5000r/min离心1小时，收集上清液第81页，课件共106页，创作于2023年2月第82页，课件共106页，创作于2023年2月上清液用硫酸铵分级沉淀收集15%~65%饱和度的蛋白质沉淀第83页，课件共106页，创作于2023年2月沉淀溶解在缓冲溶液中（20mmol/LTris-HCl，pH8.0）截流分子量30，000的超滤膜脱盐浓缩第84页，课件共106页，创作于2023年2月第85页，课件共106页，创作于2023年2月脱盐的样品和平衡缓冲液（1mmol/LNaCl）1：1混合层析柱用锌离子充分螯合，并用10倍体积的平衡缓冲液平衡第86页，课件共106页，创作于2023年2月第87页，课件共106页，创作于2023年2月第88页，课件共106页，创作于2023年2月第89页，课件共106页，创作于2023年2月上样后，平衡液冲洗，挂柱100mmol/L的NH4Cl洗脱第90页，课件共106页，创作于2023年2月第91页，课件共106页，创作于2023年2月2.重组白介素11第92页，课件共106页，创作于2023年2月人IL-11蛋白由178个氨基酸组成，分子量是19144促血小板生长因子，可直接刺激骨髓造血干细胞和巨核祖细胞的增殖用于实体瘤和白血病放、化疗后血小板减少症的预防和治疗及其它原因引起的血小板减少症的治疗大肠杆菌表达第93页，课件共106页，创作于2023年2月诱导表达4℃，3000r/min离心10分钟收集上清液孔径5000的超滤膜超滤20mmol/LTris-HCl，pH8.0缓冲液洗涤脱盐第94页，课件共106页，创作于2023年2月20mmol/LTris-HCl，pH8.0缓冲液平衡阳离子交换拄上样，NaCl梯度洗脱收集目标峰加固体硫酸铵至2mol/L上样疏水凝胶柱第95页，课件共106页，创作于2023年2月第96页，课件共106页，创作于2023年2月2~0mol/L的硫酸铵梯度洗脱5mmol/L磷酸平衡G25上样脱盐第97页，课件共106页，创作于2023年2月第98页，课件共106页，创作于2023年2月冷冻干燥第99页，课件共106页，创作于2023年2月第十节

基因工程药物介绍

第100页，课件共106页，创作于2023年2月一、重组胰岛素

胰岛素的作用是降低血糖浓度，达到治疗糖尿病的目的胰岛素是制剂,不良反应,猪胰岛素1982年开始，美国等批准用DNA重组技术生产的人源化胰岛素三种