备课素材：大肠杆菌发酵表达及代谢调控 高二下学期生物人教版选择性必修三

大肠杆菌发酵表达及代谢调控2019版高中生物学选择性必修三说，大肠杆菌广泛应用于基因工程的受体细胞：之后，再用大肠杆菌发酵获取产品。大肠杆菌及其衍生菌株是目前蛋白表达使用最广泛的菌株。与其他革兰阴性菌一样，大肠杆菌有细胞内膜与细胞外膜之分，并将细胞分成两部分空间，即细胞质与细胞周质，通常大肠杆菌表达的重组蛋白存在于细胞质。细胞质内可溶性重组蛋白易受大肠杆菌内源性蛋白酶降解，导致表达水平低下。形成包涵体的重组蛋白可有效避免内源性蛋白酶的降解，且分离纯化方便，分离效率高，但重组蛋白的复性较困难。大肠杆菌的工业化发酵主要采用营养源诱导、温度诱导、IPTG(丙基硫代半乳糖苷和乳糖诱导3种方式：1.营养源诱导营养源诱导启动子包括phoA、ugp、mgl及araB等，此种表达方式受培养基中的营养物质无机磷浓度(Pi)、糖原或生物素调控，其他尚有pH及溶氧诱导调控型，虽然其中一些表达系统的应用例子还不多,但已显示出很好的发展潜力。

2.

温敏性启动子诱导温敏性启动子有PL、PR或其杂合启动子PLPR等。发酵培养温度采用温度传感器检测并闭环控制，对于采用温敏型启动子的大肠杆菌重组菌，温度检测与控制十分关键。在发酵过程中温度陡然升高，使细胞内的酶活性加强，代谢加快，但当温度持续较高时，会引起细胞内一些酶活性降低或变性，细胞活力逐渐减弱，甚至死亡，即产生细胞内结构性变化。因此采用温敏型启动子菌株表达外源蛋白，诱导时间较短，适用于培养规模较小的重组蛋白发酵。温度控制策略通常以30℃或37℃开始培养大肠杆菌到所需的细胞密度，再升温至42℃进行诱导培养。对于温敏型表达系统，最佳的发酵过程控制方法是在42℃高温诱导培养1h后，采用温度逐渐下降的变温策略，诱导时间可明显延长，表达水平明显提高。3.

IPTG及乳糖诱导采用IPTG诱导发酵的重组菌，IPTG浓度应控制在亚适量水平，浓度过高导致细胞中毒，浓度过低引起启动子启动程度减弱，从而影响外源蛋白高效表达。另外IPTG存在于发酵液中时，对蛋白纯化亦带来一定难度。由于IPTG对细胞有一定的毒害作用、大规模发酵价格昂贵和蛋白质药物纯化操作难度增加等原因，在实际大规模发酵时，一般均采用乳糖替代IPTG。乳糖与其他碳源比例是关键因素，乳糖浓度过小，由于甘油等碳源对启动子产生阻遏作用或抑制作用，使启动子不能启动或启动强度不够易造成不表达或低水平表达，而乳糖浓度过大，会使得菌体只利用乳糖，造成碳源浪费，一般乳糖浓度约为2g/L。大肠杆菌培养过程中，特别是菌和宿主菌的生长速率、底物消耗速率、产物生成速率、质粒稳定性等动力学规律，是大肠杆菌发酵过程优化的重要基础。通过分批培养、补料分批培养和连续培养进行有关动力学研究，对制定的优化控制策略加以验证和调整改进大肠杆菌的代谢活动，可利用一些宏观变量观察和跟踪。虽然细胞水平代谢活动是肉眼无法直接观察的，但pH、溶氧、氧消耗速率、二氧化碳释放速率、呼吸商、菌体细胞生长、糖耗、氮耗等宏观变量的变化提供了代谢活动的线索，反映了菌代谢流的状况，是发酵工艺控制和干预依据，也是发酵过程放大的重要依据。配置多种传感器，利用计算机采集数据并控制的发酵罐是进行有关研究的关键手段。大肠杆菌表达系统（宿主菌、外源基因、载体等）不同时，发酵培养表现的代谢过程特征也不同。有些可通过发酵过程的操作优化（补料策略环境条件优化等）使细胞代谢正常，获得高效表达；有些可能是基因背景原因无法实现高效表达。1.

宿主菌的选择不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。现在普遍应用的大肠杆菌BL21(DE3)plysS因其带有编码T7溶菌酶的小质粒，而有效地降低杂蛋白的表达，但不影响IPTG诱导目的蛋白的表达水平，从而成为近年来最为常用的宿主菌。表达产物的形成在大肠杆菌体内有三条路径：(1)形成稳定的天然构象，可溶且有活性，不易被降解；(2)蛋白质是可溶性的，但构象为非天