分光光度法测定酱腌菜中亚硝酸盐的条件优化

分光光度法测定酱腌菜中亚硝酸盐的条件优化

腌制蔬菜采用盐的高渗透性、微生物的发酵、蛋白质的分解和其他生化作用，以抑制有害微生物的活动，并增加产品的颜色、香气和味道。目前测定食品中硝酸盐和亚硝酸盐的方法很多,根据其测定原理的不同,主要分为光谱法、色谱法、电化学法三大类,其中以分光光度法为基础的比色法使用最为广泛。ISO国际标准方法1材料和方法1.1材料表面市售酱腌菜(泡酸菜、泡萝卜、泡海椒、泡青菜、泡豇豆、泡仔姜、泡蒜)。1.2设备和设备1.2.1仪器、设备和规模UV-9200型紫外可见分光光度计北京瑞利分析仪器公司;KQ3200型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;FW-400A型高速组织捣碎机,DZKW-4电子恒温水浴锅北京中兴伟业仪器有限公司;AL204型电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司;millipore超纯水机默克密理博(Millipore)公司。以上仪器均由成都市计量监督检定测试院检定。1.2.2试剂和试剂亚硝酸钠、盐酸萘乙二胺成都市科龙化工试剂厂;对氨基苯磺酸、活性炭粉末成都化学试剂厂;硼砂成都金山化学试剂有限公司。本试验所用试剂均为分析纯;实验用水均为超纯水。1.3测试方法1.3.1样品的制备取一定量的腌制蔬菜切成小块,混匀,将试样置于高速组织捣碎机内捣碎,放入磨砂广口瓶中备用。1.3.2测试条件的优化1.3.2.反应时间对色仪测定总反应时间吸取3.00mL的亚硝酸钠标准使用液(5μg/mL)于50mL的容量瓶中,加入2.00mL的对氨基苯磺酸溶液,密塞混匀,放置3min,加1.00mL盐酸萘乙二胺溶液,加塞混匀,放置10min后定容,在波长531~550nm处用1cm的比色皿,测量吸光度。1.3.2.反应时间对色板法测量总减ld50吸取3.00mL的亚硝酸钠标准使用液(5μg/mL)于50mL的容量瓶中,加入2.00mL的对氨基苯磺酸溶液,塞紧混匀,放置1~5min,加1.00mL盐酸萘乙二胺溶液,塞紧混匀,放置10min后定容,在波长539nm处用1cm的比色皿,测量吸光度。1.3.2.反应时间对色仪测定总吸收剂用量吸取3.00mL的亚硝酸钠标准使用液(5μg/mL)于50mL的容量瓶中,加入2.00mL的对氨基苯磺酸溶液,塞紧混匀,放置3min,加1.00mL盐酸萘乙二胺溶液,加塞混匀,放置5~60min后定容,在波长539nm处用1cm的比色皿,测量吸光度。1.3.2.温度稳定性测定分别测定待测溶液于10~35℃在539nm处的吸光度,作温度-吸光度曲线,待测溶液于15~25℃其吸光度改变不超过0.002,故认为其在室温稳定(本实验于4~5月完成)。1.3.3提取试样的制备以泡酸菜为实验样品,取等质量的匀浆,加入0.4mL的标准使用液(5μg/mL)和饱和硼砂溶液后分别采取热水(70℃)提取、振荡提取、超声波提取处理试样,再将试样转移到250mL容量瓶中,加入2.5mL亚铁氰化钾溶液和2.5mL乙酸锌溶液沉淀蛋白质,定容,摇匀。静置30min冷却后过滤,滤液待测。测定吸光度和方法回收率,试验方案见表1。1.3.4标准曲线的绘制准确吸取0.00,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.50,2.00,2.50mL的亚硝酸钠标准使用液(相当于0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,7.5,10,12.5μg的亚硝酸钠),分别置于50mL的容量瓶中,加入2.00mL对氨基苯磺酸溶液,加塞混匀,放置3min,加1.00mL盐酸萘乙二胺溶液,塞紧混匀,放置10min后定容摇匀,在波长539nm处用1cm的比色皿,测量吸光度绘制标准曲线。1.4数据分析方法所得数据均为3次重复3次平行,采用Excel和DPS数据处理软件进行数据分析处理。2结果与分析2.1测试条件的选择2.1.1成折线图的图将试验所得结果以吸光度为纵坐标,绘制成折线图,见图1。由图1可知,亚硝酸盐的最大吸收波长在530~550nm先增大后减小,在539nm时吸光度值最大。2.1.2基苯磺酸反应时间试样在弱酸性介质中(pH值1.0~2.5),亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮反应,生成重氮化合物,反应时间直接决定其产物与盐酸萘乙二胺偶联成紫红色的偶氮染料的颜色,从而影响吸光度。由图2可知,加入对氨基苯磺酸溶液后,重氮化最佳的静置时间是3min。2.1.3显色体系的稳定性由图3可知,在室温25℃条件下,随显色时间的延长,化合物的吸光度在10min时趋于稳定,显色后生成的络合物在10~50min保持稳定,在此期间测定可以满足实验要求。按照试验方法,测定不同时间显色体系的吸光度时,10min即可显色完全。同时通过实验发现,环境温度对显色时间有一定影响,一定范围内,温度越高,显色稳定时间越短,衰退也越快。2.1.4吸光度的测定将样品放置在10~35℃的条件下,显色15min后进行吸光度的测定,结果见图4。吸光度基本没有变化,由此可知,温度对亚硝酸盐的测定值影响基本可以忽略不计,但能影响到显色时间和衰退时间。2.1.5标准曲线的测试基于上述单因素实验的分析,综合各因素的影响,在最优条件下测试标准曲线。由图5可知,以吸光度(Y)对亚硝酸钠标准品浓度(X)的线性回归方程为:Y=0.072X+0.003,R2.1.6不同时间前处理方法样品中亚硝酸盐测定结果将混合均匀的试样与加标后(相当于2mg/kg)的试样在保证其他实验条件相同的情况下,分别用热水浴、沸水浴、超声波以及振荡等方法提取亚硝酸盐,在不同处理时间下得到亚硝酸盐的测定结果见表2~表5。由表2的结果可知,热水提取法的处理时间对样品中亚硝酸盐含量的测定以及亚硝酸盐回收率都有较大影响,随着时间的增大,样品亚硝酸盐的测定结果呈增加趋势,到25min后维持不变,回收率介于73.5%~88.0%。当采用沸水浴处理样品时,亚硝酸盐测定结果在10min以后达到峰值,25min后出现下降趋势,结合表1和表2的结论比较,热水浴较沸水浴对亚硝酸盐的提取更彻底(由于亚硝酸盐在高温下被氧化,使结果偏低),回收率也更高,但是沸水浴处理样品的时间要更短。由表3可知,超声波处理样品10min后亚硝酸盐的测定结果即可达到峰值,而后续处理均对结果影响不大,加标回收率更是达到91.5%~96%。振荡提取处理样品时,明显测定的样品亚硝酸盐的含量偏低,说明其提取不完全。综合4种前处理方法,振荡提取法的亚硝酸盐提取率和回收率都较低,热水浴和沸水浴的亚硝酸盐提取率虽然较高,但是耗时长、操作繁琐,而且时间过长、温度过高时都会使亚硝酸盐氧化,影响测定结果。而超声提取法的亚硝酸盐回收率和提取率都很高,且超声提取所需时间较短、操作简便易行,所以超声提取法为4种提取方法中的最佳提取方法。2.2方法精密度和加标回收率将实验条件的优化结果运用于其他酱腌菜亚硝酸盐的测定,选择6个样品,做10个平行实验,分析其精密度和加标回收率,确定该方法的适应性和实用性,结果见表6。由表6可知,该方法对酱腌菜亚硝酸盐的测定有很高的适应性和实用性,所测定6种样品的重现性很好,而且加标回收率均达到较高水平。3亚硝酸盐的测定本研究对酱腌菜亚硝酸盐测定的条件进行优化,确定最优条件:测定波长为539nm,重氮化时间为3min,显色时间为10~50min,线性回归方程为Y=0.072X+0.003,R由研究结果可得:重氮化的时间和吸收波长对酱腌菜亚硝酸盐的测定影响较大,在实验中要严格控制时间;显色的络合物在10~50min保持稳定,能较从容地完成实验,实用性好;比较4种前处理方法,热水浴和沸水浴在温度过高、时间较长时均会使一部分亚硝酸盐氧化,影响测定结果;采