脂肪酶催化合成异丁酸异戊酯的研究

脂肪酶催化合成异丁酸异戊酯的研究

生物酶催化法生产的酯具有天然产品的质量，比其他传统的生物酶生产法的产品质量好。以表面活性剂、有机溶剂和水构成的反相微乳液体系作为微反应器,已经在蛋白质的提取、酶催化及材料合成等领域得到广泛的应用近年来,我们初步研究了反胶束体系中脂肪酶(CCL)催化合成异丁酸异戊酯的可行性及其机理1实验部分1.1化学试剂及试剂圆柱状假丝酵母脂肪酶(CCL,LipasefromCandidacylindracea),Fluka公司出品,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,分析纯,北京化工厂),十二烷基苯磺酸(DBSA,纯度≈97%,日本TokyoKaseiKogyo有限公司出品);异丁酸、异戊醇、异辛烷等均为分析纯,购自上海化学试剂一厂;水为去离子水.磁力搅拌器(上海南汇电讯器材厂),pHS-2C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂),薄膜旋转蒸发仪(上海医疗器械厂),VarianCP-3380气相色谱仪(附FID,美国Varian公司).1.2酶微乳液的制备分别配制浓度为50mmol·L1.3制备成分配产物的转化率向上述微乳液中加入物质的量比为1∶2的异丁酸和异戊醇,在一定温度下继续搅拌开始反应,每隔一定时间取样,用气相色谱进行定量分析,计算产物的转化率.1.4内标法定量的确定所用色谱柱为交联FFAP50m×0.25mm×0.25µm的毛细管柱,样品在60℃保留2min后以10℃/min程序升温到200℃,保留10min,再以30℃/min程序升温,到250℃保留10min.取反应混合物200µL置于含有5mL丙酮的具塞刻度试管中,以乙酸丁酯为内标,采用内标法定量反应混合物中的异丁酸和产物酯的含量,以反应掉的异丁酸的量计算转化率.2结果与讨论2.1不同表面活性剂在dbsa/异辛烷微乳体系中的反应转化率比较CTAB和DBSA微乳体系中酯合成反应的转化率与时间关系的反应进程曲线如图1所示.由图1可以看出DBSA/异辛烷微乳体系中酶催化合成异丁酸异戊酯反应的转化率始终高于CTAB/异辛烷体系,特别是在反应初期,DBSA体系的反应速度非常快,反应3h时转化率已达84%,24h可达90%以上,而CTAB/异辛烷体系中反应转化率在24h达75%左右,70h后转化率达90%可见,在DBSA微乳体系中进行酯合成反应具有明显的优势.这是由于DBSA/异辛烷微乳体系中,一方面DBSA与CTAB具有相同的功能——作为表面活性剂构建微乳体系,既能增大反应界面,提高反应物的碰撞频率,又能为酶提供优越的微环境,使酶充分发挥生物活性;另一方面DBSA又与CTAB不同,它作为一种质子酸,对于可逆的酯合成反应可能具有酸催化的作用.反应9h后,DBSA体系的转化率没有较明显的增加,有可能是酶在酸性较强的DBSA体系中失活所致.70h之后,两条曲线逐渐接近,转化率均可达到95%左右.以上结果表明,微乳体系为酶催化反应创造了良好的微环境,能较好地实现酶催化酯合成反应,反应条件温和,反应转化率较高.同时也表明,DBSA/异辛烷反相微乳能大大提高合成异丁酸异戊酯的效率,是更为合适的微乳液酶催化体系.2.2无酶体系对dbsa反应的影响为了确定DBSA反相微乳液体系中表面活性剂DBSA的酸催化的作用,我们在该体系中进行了有酶和无酶条件下酯合成反应的对比实验,结果列于图2.由图2可知,在没有酶存在的条件下,反应也能够发生,而且最高转化率也可达到90%以上,但无酶体系在反应初期的反应速度低于有酶体系,转化率也不及有酶体系(10h之前).该结果表明,DBSA确实具有酸催化的作用.据此,我们可以进一步考虑改善反应条件,提高无酶条件下的反应转化率,以节省价格比较贵重,并且容易失活的生物酶,该项研究正在进行中.2.3微乳液中的水含量w我们考察了反应6h条件下两个体系的反应转化率的变化情况,如图3所示,CTAB/异辛烷体系在w2.4温度对转化率的影响如图4所示,反应温度对CTAB/异辛烷反相微乳液体系中酶催化反应的影响呈钟形曲线趋势,在较低的温度范围内,随着温度的升高反应速度加快,转化率提高与通常的动力学反应规律相同.超过40℃之后,由于较高温度下难以保持酶的活性构象,往往使酶活力降低,导致反应速度反而随温度升高而下降.对于DBSA异辛烷反相微乳液体系,反应转化率随温度升高而增加,在45℃以后转化率趋于平缓.这是由于较高温度虽可能使一部分酶失活,但较高温度有利于DBSA的酸催化作用,所以45℃之后,并未出现转化率下降的现象.2.5缓冲液ph值对转化率的影响酶分子上有许多酸性、碱性氨基酸的侧链基团,它们随着pH值的变化处于不同的解离状态,或者直接影响与底物的结合和进一步反应,或者影响酶的空间结构,从而影响酶的活性.也就是说,体系缓冲液pH值的改变将引起酶构象的改变,进而影响酶的催化能力.如图5所示,两个体系中酯化反应的转化率随pH值的变化趋势均呈钟形曲线,最佳pH值均在pH=7.0处,这是因为酶是生物催化剂,比较适合中性环境.但pH值较低时反应转化率普遍要高于pH值较高的情况,这是由于酸性环境会有利于可逆反应向生成酯的方向移动.2.6表面活性剂和酶催化剂根据以上的实验结果分析,DBSA微乳液体系中的脂肪酶催化合成异丁酸异戊酯应服从微乳液、酶以及酸三重催化的机理,即:1.DBSA是一种表面活性剂,它在有机溶剂中能自发形成热力学稳定的微乳体系,不仅能极大地增加反应物的接触界面,提高反应速率,实现微乳催化,同时,酯合成反应的产物水能被反胶束增溶进入水池内部,从而使反应平衡向产物方向移动,提高酯合成反应的转化率;2.酶催化剂被增溶于微乳液的水滴之中,适量的自由水将使酶处于比较松弛的状态,保持较高的生物活性,较好地发挥酶催化作用;3.DBSA又是一种酸性与H3dbsa作表面活性剂的优势本文对CTAB/异辛烷及DBSA/异辛烷微乳液体系中脂肪酶催化合成异丁酸异戊酯进行了系统的研究,发现DBSA体系对于异丁酸异戊酯的合成具有明显的优势.研究表明,DBSA在反应过程中发挥了重要的作用作为表面活性剂,它能形成热力学稳定的微乳液,为酯合成反应提供极大的相界面,提高反应速度,实