益生菌对发酵乳流变学特性及质构特性的影响

益生菌对发酵乳流变学特性及质构特性的影响

几千年来，世界上许多国家已经生产了许多不同类型的发酵出版物。世界各地的消费者越来越感兴趣其副作用的有益效果，人们越来越意识到食品与健康之间的重要关系。在功能性发酵乳中，含有益生菌的产品在世界范围内呈迅猛上升的趋势干酪乳杆菌Zhang和乳双歧杆菌V9是我国自主开发具有良好益生特性的益生菌菌株，已广泛应用于食品。干酪乳杆菌Zhang分离自内蒙古正蓝旗传统发酵酸马奶，对酸和胆盐胁迫具有较高的耐受性，有降低血脂，调节免疫系统，抗氧化和抑制肠道病原菌生长等益生菌功效消费者会被益生菌产品的健康功效所吸引，然而值得注意的是，产品的质构特性才是消费者喜好的首要因素。此前研究发现，益生菌干酪乳杆菌Zhang和乳双歧杆菌V9在发酵乳中具有非常好的稳定性，同时其与嗜热链球菌复配发酵可赋予产品较好的风味，然而，目前研究只局限于pH值、滴定酸度（TA）、黏度和持水性等发酵和贮藏的宏观特性，未进行深入分析1材料和方法1.1培养基和培养基纯牛乳（蛋白质：3.0g/100g，脂肪：3.7g/100g），蒙牛MRS固体培养基、M17固体培养基，Oxoid公司；万古霉素，北京陆桥技术股份有限公司；氯化锂，广东环凯微生物科技有限公司。1.2微流变仪器和全波长监测粘度计（DV2T），美国Brookfield公司；质构仪（TA-XTplus），英国StableMicroSystem公司；微流变分析仪（RheolaserMaster型），法国Formulaction仪器公司；全波长酶标仪（SpectraMaxM2），美国MolecularDevices公司；超净工作台（SJ-CJ-2FDQ），苏州苏洁净化设备有限公司；高压均质机（SRH60-70），上海申鹿均质机有限公司；雷磁pH计（pHSJ-3F），上海精密科学仪器有限公司。1.3测试方法1.3.1接种量、发酵乳样品的制备发酵乳以纯牛乳和蔗糖（质量分数6%）为基料，分为4组，均接种酸奶基础发酵剂，以37-1为对照组，具体接种量见表1。发酵乳样品制作过程：将蔗糖按比例完全溶解于牛乳中，加热至60℃，均质（20MPa),95℃杀菌5min，水浴冷却至37℃，接种发酵，至pH4.6为终止，立即搅拌并水浴冷却，直到温度降到20℃后无菌分装，于4℃条件下贮存21d。每个试验组3个平行样。1.3.2发酵菌种的制备采用平板计数法测定活菌数。各菌种在发酵期间每2h和发酵终点以及贮藏期第1,7,14,21天计数。准确称取25.0g样品至装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，加入225mL的无菌NaCl生理盐水0.85%（质量分数），振荡混匀15min后，取1mL稀释液至9mL生理盐水中，并依此进行倍比稀释，取合适梯度倾注培养。嗜热链球菌采用M17固体培养基加1.0%（质量分数）乳糖，42℃培养48h。保加利亚乳杆菌采用MRS固体培养基（冰乙酸调整pH5.2),37℃培养48h，对于添加干酪乳杆菌Zhang的样品，要减去相应干酪乳杆菌数量。干酪乳杆菌Zhang采用添加0.01‰（质量分数）万古霉素的MRS固体培养基，37℃培养72h。乳双歧杆菌V9采用含半胱氨酸和莫匹罗星锂盐的改良MRS固体培养基，37℃培养72h。均在厌氧条件下培养1.3.3发酵过程中光学因子的变化采用光学微流变仪检测发酵期间发酵乳的流变学特性。将接种后的基料各20mL小心转移至灭菌的配套样品瓶中，注意保持玻璃瓶壁的清洁，以免造成光学信号偏差。放入测定槽，于37℃观测发酵过程中的黏度因子（Viscosityindex,VI）、弹性因子（Elasticindex,EI）以及固液平衡值（Solidliquidbalance,SLB）随时间的变化情况。每隔5min采集1次数据，测定至发酵终点1.3.5储藏期稳定性分析1.3.5.1酸采用国标《食品安全国家标准食品酸度的测定滴定酸度》（GB5009.239-2016）中“酚酞指示剂法”测定，以评价发酵乳后酸。1.3.5.测定子的转速、扭矩发酵乳样品放至室温后进行测定，采用4#转子，转速为100r/min，扭矩为10%～100%，测定时间为30s。所测定的黏度值为发酵乳的有效黏度值，每组3个平行。1.3.5.3.保水准确称取发酵乳样品20.0g于50mL离心管中，5000×g离心10min后收集滤液并称重，按式（1）计算。1.3.6提取和测定额外糖的含量采用Kearney等1.3.7数据分析方法微流变数据采用RheolaserMaster型光学法微流变分析仪自带的Smart软件进行数据分析。所有图表采用Orgin9.1绘制。试验数据采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析（One-WayANOVA）统计学分析，显著性水平设定为0.05。2结果与分析2.1发酵期间不同益生菌含量对发酵过程的影响各组发酵乳在发酵及贮藏过程中保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌Zhang和乳双歧杆菌V9的活菌数含量以及pH值变化情况如图1所示。各组中作为基础发酵剂的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的生长趋势基本一致，都是在发酵期间迅速增加，到后熟后含量达到最高，贮藏期数量逐渐减少。与对照组37-1相比，在添加单一或复配益生菌时能够促进发酵过程中保加利亚乳杆菌的生长，在贮藏期没有影响。37-2组发酵乳中乳双歧杆菌V9活菌数在21d贮藏期末的活菌数为（2.04±0.12）×10为确保益生菌有益作用的发挥，欧盟和澳洲标准要求益生菌产品中的活菌数量应不低于10此外，发现37-2、37-3、37-4组到达发酵终点pH4.5所需的时间分别为9.2,9.0,8.8h，对照组37-1为9.4h，即添干酪乳杆菌Zhang和/或乳双歧杆菌V9均缩短了发酵时间。Akalin等2.2发酵乳中的使用45.4%氧传质因子2的变化菌株代谢产生的EPS可以极大改善发酵乳的流变特性和感官品质。本研究对各组发酵乳样品在贮藏期间的EPS含量进行测定，如图2所示，37-2、37-3、37-4的EPS含量显著高于37-1(P<0.05），表明添加益生菌干酪乳杆菌Zhang和/或乳双歧杆菌V9可以显著增加发酵乳中EPS含量，且各组EPS总含量在贮藏期间逐渐增加。其中，对照组37-1的EPS含量从发酵1d的（64.4±5.4)mg/L到21d的（351.6±5.4)mg/L，约增加5.4倍；37-2、37-3、37-4组分别从（361.1±20.1),(546.3±31.5),(515.2±17.5)mg/L增加到（903.6±33.9),(1165.4±37.8),(1103.8±45.6)mg/L，分别增加了2.5,2.1,2.2倍，说明添加益生菌组在发酵期间可以代谢产生大量的EPS，然而在4℃贮藏期间EPS增量较对照组少。值得注意的是，37-3组中EPS含量始终显著高于37-2组（P<0.05），说明干酪乳杆菌Zhang较乳双歧杆菌V9具有更强的产EPS能力。张文弈在整个贮藏期，37-2组中EPS的含量较为稳定，37-3组在前7d增加较快后趋于恒定，37-4组在持续增加，之后增速渐缓。对比活菌数结果发现，干酪乳杆菌Zhang在贮藏期间仍有增殖，可以继续代谢产生EPS，这可能是含该菌株的发酵乳EPS持续增加的原因。在将干酪乳杆菌Zhang和乳双歧杆菌V9复配时发现发酵乳中的EPS含量并没重叠增加，多菌株协同作用下EPS的代谢情况还有待进一步分析研究。最新研究表明，不同菌种产生的EPS或同一菌种的不同株在乳发酵过程中产生EPS的摩尔质量、重复单元结构和产量可能不同2.3发酵乳中黏度因子的变化酪蛋白凝胶是发酵乳结构形成的主要结构组成部分，呈动态变化，在发酵时凝胶化之前及形成凝胶网络过程中存在颗粒重排本研究中，各组发酵乳的黏性因子、弹性因子表现出相同的变化模式。最初，各组发酵乳的弹性因子保持稳定，到5h时37-4组最先形成凝胶结构，这与37-4组所需发酵时间最短的结果一致。同时，所有发酵乳的黏性因子保持在同一水平的小波动，在凝胶点出现骤增后缓慢增加峰值。所有发酵乳在发酵终点时均表现出弱黏弹性凝胶特征，这与报道一致2.4价添加益生菌菌种对发酵乳性质的影响本研究对所有益生菌组和对照组的搅拌型发酵乳样品在后熟后的质构进行测定，以评价添加益生菌菌种对发酵乳质地的影响（表2）。测定参数包括硬度、稠度、内聚性和黏度指数，硬度定义为达到最大深度所需的力，黏度指数由单循环复位时所受的力产生面积计算而得，指将压缩活塞从样品中拉出所需的功。硬度是决定酸奶质量的关键参数2.5发酵乳后酸稳定性测定本研究跟踪监测了各组发酵乳样品在贮藏期间的滴定酸度、持水性和黏度变化情况，以综合评价接种干酪乳杆菌Zhang和/或乳双歧杆菌V9的发酵乳后酸及稳定性情况，具体结果如表3所示。2.5.1益生菌对剂量稳定性的影响发酵乳后酸是影响酸奶风味和组织状态的重要因素。各组发酵乳在后熟1d时滴定酸度没有显著差异（P>0.05），在贮藏期间均呈增加趋势。在14d时37-3和37-4的滴定酸度高于其它2组（P<0.05），在21d时37-4的滴定酸度高于37-1和37-2组（P<0.05）。然而，从总体贮藏期间滴定酸度的增量ΔTA角度分析，添加益生菌组37-2、37-3、37-4与对照组37-1比较并无差异。表明添加益生菌总体上不会影响发酵乳在贮藏期间滴定酸度的增加量，反应出添加干酪乳杆菌Zhang和/或乳双歧杆菌V9对发酵乳贮藏时的后酸化程度没有影响。Purwandari等2.5.2复合发酵过程中蛋白质网络结构稳定性的变化乳清析出是发酵乳制品中一种普遍存在的质量缺陷，持水性用于衡量发酵乳的乳清存在于蛋白质网络结构的稳定性。本研究中，样本37-3和37-4在贮藏期间持水性显著高于37-1和37-2(P<0.05），这与在发酵过程中表现出的高内聚性一致。表明添加单一干酪乳杆菌Zhang和复配时均能够提高发酵乳的持水性，这一结果和陈世贤等2.5.3益生菌添加量对发酵乳黏度的影响在本研究中，益生菌组37-2、37-3、37-4在贮藏期间各个时间点的黏度均显著高于对照组37-1(P<0.05），而37-3、37-4的黏度显著高于37-2，说明添加益生菌可提高发酵乳黏度，并且含有干酪乳杆菌Zhang（包括单一和复配）的发酵乳黏度都大于只添加乳双歧杆菌V9组。EPS含量高的益生菌组表现出的黏度较高，这一现象与先前报道一致3益生菌发酵乳制备的优化工程本研究首次对添加益生菌干酪乳杆菌Zhang和/或乳双歧杆菌V9发酵乳中EPS含量进行测定，并对发酵过程流变学特性、发酵乳质构参数和贮藏期间稳定性的影响进行分析，发现在添加益生菌干酪乳杆菌Zhang和/或乳双歧杆菌V9能够显著增加发酵乳中的EPS含量，EPS有利于在发酵过程中形成紧密的凝胶网络，尤其是添加干酪乳杆菌Zhang组表现出较高的弹性因子和较低的固液平衡值，具有高强度的凝胶结构。发酵乳硬度和黏度指数高低顺序与各组EPS含量高低顺序基本一致，益生菌组高于对照组。在贮藏期间，添加益生菌对发酵乳后酸化程度没有影响，可增加发酵乳黏度，添加干酪乳杆菌Zhang（单一和复配）能提高发酵乳的持水性。同时，益生菌活菌数在贮藏期末仍在10综上，在发酵乳中添加益生菌干酪乳杆菌Zhang和/或乳双歧杆菌V9不仅能够赋予发酵乳益生功效，而且能够改善质构特性和贮藏稳定性，为实际生产、推广应用提供数