微生物观察技术-微生物形态观察技术

不染色标本检查法是检查细菌的运动性等生理活动的方法，因此是细菌活标本检查的方法，常用的有压滴法、悬滴法等。

一、压滴法用接种环依次取生理盐水和细菌培养物，置于洁净的载玻片中央，使其成为均匀的菌悬液，覆以盖玻片。检查时先用低倍镜找到适宜的位置，再用高倍镜和油镜观察。观察时必须缩小光圈，适当下降聚光器，以造成一个光线较弱的视野，才便于观察细菌的运动情况。二、悬滴法

将细菌液滴于洁净的盖玻片上，另取一张凹玻片，在凹孔周边涂一薄层凡士林，然后将其凹面向下，对准盖玻片中央并盖于其上，然后迅速翻转，用小镊子轻轻按压。观察时先用低倍镜找到悬滴边缘，再换高倍镜观察（因凹玻片较厚，一般不用油镜）,可观察到细菌的运动状态。谢谢不染色标本检查法

是检查细菌的运动性等生理活动的方法，因此是细菌活标本检查的方法，常用的有压滴法、悬滴法等。

一、压滴法

用接种环依次取生理盐水和细菌培养物，置于洁净的载玻片中央，使其成为均匀的菌悬液，覆以盖玻片。检查时先用低倍镜找到适宜的位置，再用高倍镜和油镜观察。观察时必须缩小光圈，适当下降聚光器，以造成一个光线较弱的视野，才便于观察细菌的运动情况。

二、悬滴法

将细菌液滴于洁净的盖玻片上，另取一张凹玻片，在凹孔周边涂一薄层凡士林，然后将其凹面向下，对准盖玻片中央并盖于其上，然后迅速翻转，用小镊子轻轻按压。观察时先用低倍镜找到悬滴边缘，再换高倍镜观察（因凹玻片较厚，一般不用油镜）,可观察到细菌的运动状态。

染色标本检查法

细菌细胞无色半透明，需经过染色才能在光学显微镜下清楚地看到。常用的细菌染色法包括单染色法和复染色法。单染色法是只用一种染料使细菌着色，如美蓝染色法、石炭酸复红染色法等。可以观察细菌的大小、形态与排列形状，但各种细菌均染成同一颜色，不能鉴别细菌。复染色法是用两种或两种以上的染料染色，可使不同菌体呈现不同颜色，所以又称鉴别

革兰氏染色法

最常用的复染色法是革兰氏染色法，由丹麦植物学家ChristianGram创建于1884年，通过革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性菌（蓝紫色）和革兰氏阴性菌（红色）两大类。其染色过程是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。

革兰氏染色的机理与细菌细胞壁的结构和化学组成有关。革兰氏阳性菌肽聚糖含量高，层次较多，故细胞壁比较厚，细胞壁上的间隙较小，煤染后形成的结晶紫-碘复合物就不易细脱出细胞壁，加之它脂类含量很少，经乙醇洗脱后，肽聚糖层的网孔脱水而变得通透性更小，于是蓝紫色的结晶紫-碘复合物就留在细胞内而呈蓝紫色。而革兰氏阴性菌肽聚糖含量低，层次也较少，故细胞壁较薄，其上孔隙较大，加之细胞壁脂类含量高，经乙醇洗脱后，细胞壁因脂质被溶解而孔隙更大，所以结晶紫-碘复合物极易洗脱出细胞壁，酒精脱色后成无色，复染时被石炭酸复红染成红色。

谢谢细菌的简单染色

1、涂片取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸溜水)于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从枯草芽孢杆菌、大肠杆菌斜面和啤酒酵母菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液(或液体培养物)涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。

2、干燥室温自然干燥。

3、固定涂面朝上，通过火焰3-4次。此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。4、染色将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液1～2滴于涂片上，染液刚好覆盖涂片薄膜为宜。吕氏碱性美蓝染色1～2min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min。

5、水洗不倒去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。

6、干燥自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。

7、镜检涂片干后镜检。谢谢一、革兰染色原理革兰氏阳性菌肽聚糖含量高，层次较多，故细胞壁比较厚，细胞壁上的间隙较小，煤染后形成的结晶紫-碘复合物就不易细脱出细胞壁，加之它脂类含量很少，经乙醇洗脱后，肽聚糖层的网孔脱水而变得通透性更小，于是蓝紫色的结晶紫-碘复合物就留在细胞内而呈蓝紫色。而革兰氏阴性菌肽聚糖含量低，层次也较少，故细胞壁较薄，其上孔隙较大，加之细胞壁脂类含量高，经乙醇洗脱后，细胞壁因脂质被溶解而孔隙更大，所以结晶紫-碘复合物极易洗脱出细胞壁，酒精脱色后成无色，复染时被石炭酸复红染成红色。

（一）细菌涂片标本的制作1、涂片取洁净的载玻片一张，滴一小滴生理盐水于载玻片中央（也可用接种环取一环生理盐水滴入载玻片中央）；将接种环在火焰上烧灼灭菌，冷却后，无菌操作方法在培养基表面轻轻刮取少许待染色的细菌，混入载玻片的生理盐水中，以画圈的形式由内向外均匀地抹成直径1.5cm左右的涂层薄片；将接种环灭菌后放回原处。注：如用菌液制作涂片，则不加生理盐水，直接用接种环取菌液涂抹于载玻片上。2、干燥将上述涂片置于试管架上，任其自然干燥，也可将涂面朝上，在酒精灯上稍微烘干，但切勿离火焰太近，因温度过高会破坏菌体形态。

3、固定手持载玻片一端，涂有细菌标本的一面朝上，将载玻片在酒精灯火焰外焰来回通过3次，使涂抹的细菌固定于固定于载玻片上，固定时，温度不能过高，千万不得将载玻片停于火焰上烧灼。（二）细菌革兰染色标本片的制作

1、初染将细菌涂片平置于试管架上，滴加结晶紫染液于细菌涂片处，使其布满菌膜，染色时间为1min，用细水流徐徐冲洗取多余染液，甩去载玻片上过多的积水（以防影响下一种染液的浓度）。

2、媒染滴加卢戈碘液于涂片位置，维持1min，用细水流洗取，将载玻片上过多的积水甩去。3、脱色加95％乙醇数滴于载玻片上，摇动载玻片让乙醇来回流动，使脱色均匀，倾去紫色酒精液；如涂片较厚可再滴加95％乙醇，继续摇动载玻片直至无紫色染料脱出为止。脱色时间约30~40s，脱色后，立即用水冲洗除去乙醇，甩去积水。也可将玻片倾斜，连续滴加95％乙醇至涂片处进行脱色20~30s至流出的乙醇无色为止，立即用细水流冲洗。乙醇的浓度、用量、涂片的厚度、染色时间都会影响脱色的效果，脱色是革兰染色中最关键的一步，脱色不足，革兰阴性菌仍保留紫色可造成假阳性；反之，脱色过度，革兰阳性菌也可被染成红色。

4、复染滴加复红染液于涂片位置，染色1min，用水冲洗去染液，甩去载玻片上积水。让载玻片自然干燥或用吸水纸印干水分，切勿擦拭。将染好的涂片标本用吸水纸印干后，加一滴香柏油，置显微镜油镜下观察染色结果谢谢酵母菌制片方法知识点染色原理酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的．而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别

酵母菌简单染色方法：

1、涂片取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸溜水)于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从枯草芽孢杆菌、大肠杆菌斜面和啤酒酵母菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液(或液体培养物)涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。

2、干燥室温自然干燥。

3、固定涂面朝上，通过火焰3-4次。此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。4、染色将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液1～2滴于涂片上，染液刚好覆盖涂片薄膜为宜。吕氏碱性美蓝染色1～2min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min。

5、水洗不倒去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。

6、干燥自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。

7、镜检涂片干后镜检。

酵母活体染色

1、在载玻片中央加一滴美蓝染液，然后按无菌操作法取培养48小时的面包酵母少许，放在美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合，染色2～3min。

2、用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。

3、将制好的水浸片放置3min后镜检。先用低倍镜观察到清晰的视野后，再用高倍镜观察，根据是否染上颜色来区分死、活细胞，记录细胞形态，注意观察酵母菌细胞的大小、形状及芽殖情况。谢谢1、插片法

（1）倒平板

取融化并冷至大约50

℃

的高氏1

号琼脂约20

而倒平板，凝固待用。（2）接种用接种环挑取菌种斜面培养物（孢子）在琼脂平板上划线接种。

（3）插片以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以大约45°角插入琼脂内（插在接种线上），插片数量可根据需要而定。

（4）培养将插片平板倒置，28

℃

培养，培养时间根据观察的目的而定、通常3

~5d

。

（5）镜检

用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面培养物，然后将有菌的一面朝上放在载玻片上，直接镜检。

2

、玻璃纸法

（1）倒平板

同插片法。

（2）铺玻璃纸

以无菌操作用镊子将已灭菌（155～160

℃

干热灭菌2h

）的玻璃纸片（似盖玻片大小）铺在培养签琼脂表面，用无菌玻璃涂棒（或接种环）将玻璃纸压平，使其紧贴在琼脂表面，玻璃纸和琼脂之间不留气泡。每个平板可铺5

~

10

块玻璃纸。也可用略小于平皿的大张玻璃纸代替小纸片，但观察时需要再剪成小块。

（3）接种

用接种环挑取菌种斜面培养物（孢子〕

在玻璃纸上划线接种。

（4）培养

将平板倒里，28

℃

培养3~5d

。

（5）镜检

在洁净载玻片上加一小滴水，用摄子小心取下玻璃纸片，菌面朝上放在玻片的水滴上，使玻璃纸平贴在玻片上（中间勿留气泡），先用低倍镜观察，找到适当视野后换高倍镜观察。操作过程，勿碰动玻璃纸面上的培养物。3

、印片法

（1）接种培养

用高氏I

号琼脂平板，常规划线接种或点种，28

℃

培养4

~

7

d

。也可用上述两种方法所使用的琼脂平板上的培养物，作为制片观察的材料。

（2）印片

用接种铲或解剖刀将平板上的菌苔连同培养基切下一小块，菌面朝上放在一载玻片上。另取一洁净载玻片里火焰上微热后，盖在菌苔上。轻轻按压，使培养物（气丝、孢子丝或孢子）粘附（“印”）在后一块载玻片的中央，有印迹的一面朝上，通过火焰2

~3

次固定。

（3）染色用石炭酸复红覆盖印迹，染色约1min后水洗。

（4）镜检

干后用油镜观察。谢谢

1、直接制片观察法

在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘处挑去少量已产生孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，在放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。挑菌和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态：加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。2、载玻片培养观察法

（1）培养小室的灭菌在平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，在放一U形棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，包扎后于121°C灭菌30min，烘干备用。

​​（2）琼脂块制作取已灭菌的马铃薯琼脂（或察氏琼脂）培养基6~7ml注入另一灭菌平皿中，使之凝固成薄膜。用解剖刀切成0.5~1cm3的琼脂块，并将其移至上述培养室