色谱分离技术-色谱分离理论基础（药物分离纯化课件）

药物分离与纯化技术课程色谱分离技术-色谱分离的依据色谱分离的依据-色谱分离技术大纲1.阻滞因数或比移值Rf2.新型分离与纯化技术的研究和开发色谱分离的依据-色谱分离技术依据混合物中各组分物理化学性质（如吸附力、分子形状及大小、分子的荷电性、溶解度及亲和力等）的差异，通过物质在两相间反复多次的平衡过程，使各组分在两相中的移动速度或分布程度不同，表现为各组分的流出次序不同，而使各组分分离的技术。

色谱分离一般属于物理分离方法，其最基本的特征是有一个固定相和一个流动相，各组分的分离发生在两相进行相对运动的过程中。1.色谱分离技术色谱分离的依据-色谱分离技术在定温定压条件下，当色谱分离过程达到平衡状态时，某种组分在固定相S和流动相m中含量（浓度）C的比值，称为平衡系数K（也可是分配系数、吸附系数、选择性系数等）。1.色谱分离技术色谱分离的依据-色谱分离技术平衡系数K主要与下列因素有关：

①被分离物质本身的性质；

②固定相和流动相的性质；

③色谱柱的操作温度。

一般情况下，温度与平衡系数成反比，各组分平衡系数K的差异程度决定了色谱分离的效果，K值差异越大，色谱分离效果越理想。1.色谱分离技术色谱分离的依据-色谱分离技术柱色谱分离过程如图所示。当混合物被流动相带入色谱柱并在柱中移动时，由于各组分在固定相中的分配系数或溶解、吸附、交换、渗透或亲和能力的差异，使各组分随流动相移动的速率不同；

因此当流动相移动一定柱长后，使各组分在色谱柱内分层，从而达到各组分分离的目的。2.色谱分离过程色谱分离的依据-色谱分离技术混合液中各组分对固定相的吸附能力的大小次序为：白球分子〇＞黑球分子●＞三角形分子△。将三种组分的混合物加入色谱柱的顶端（图(a)），然后加入流动相（展开剂、洗脱剂），在重力或压力差的作用下，流动相向下移动，各组分在两相间不断地发生吸附、解吸、再吸附、再解吸…的过程，连续多次的吸附平衡过程是吸附色谱分离的基础。2.色谱分离过程色谱分离的依据-色谱分离技术如果各组分与固定相的吸附力相同，则各组分以相同的速率随流动相一起向下移动，而不能被分离。如果混合物中各组分与色谱柱中固定相的吸附力大小不同，通过在柱中反复多次地吸附和解吸，使各组分间不断地发生差速迁移（如图(b)～(g)所示2.色谱分离过程色谱分离的依据-色谱分离技术最后，作用力最弱的“△”分子随流动相的移动速率快，最先从色谱柱中流出（图(h)），中等吸附力的“●”分子在中间流出，吸附力最大的“〇”分子最后从柱中流出，实现了各组分的分离。2.色谱分离过程色谱分离的依据-色谱分离技术从色谱分离过程可看出，差速迁移是色谱分离的基础，混合物中各组分理化性质的差异、固定相的吸附能力和流动相的解吸（洗脱）能力是产生差速迁移的三个最重要的因素。

2.色谱分离过程色谱分离的依据-色谱分离技术在色谱分离操作中，将加入流动相使各组分分层的操作过程，称为展开操作。

展开后各组分的分布情况，称为色谱图。

加入洗脱剂，使各组分分别从色谱柱中流出的操作过程，称为洗脱操作。

从柱中流出的含有某一组分的溶液，称为洗脱液。

在实际的色谱分离操作中，有时展开与洗脱合并为一个操作过程。2.色谱分离过程色谱分离的依据-色谱分离技术色谱分离的检测控制一般采用某种形式的电讯号，电讯号的大小反映了物质的量的多少，因色谱分离中各组分的流出时间不同，可通过检测器及记录仪来获得色谱分离的有关信息。2.色谱分离过程色谱分离过程原理图药物分离与纯化技术课程色谱分离技术--色谱图及基本概念色谱图及基本概念—色谱分离技术大纲1.色谱图2.色谱图的几个基本概念色谱图及基本概念—色谱分离技术混合液中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱柱进入检测器，检测器的响应信号—时间曲线或检测器的响应信号—流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，又称色谱图，如图所示。

色谱图的纵坐标为检测器的响应信号；横坐标为时间t，也可用流动相体积V或距离L表示。（一）色谱图色谱图及基本概念—色谱分离技术

1．基线在操作条件下，色谱柱出口处没有组分流出，仅有纯流动相流过检测器，此时的流出曲线称为基线，如图中OC曲线。使基线发生细小波动的现象称为噪音，如图中的空气峰。基线反映了操作条件下，检测器系统噪声随时间变化的波动情况，稳定的基线应是一条平行于横坐标的直线。（二）色谱图的几个基本概念色谱图及基本概念—色谱分离技术2．色谱峰当样品中的组分随流动相流入检测器时，检测器的响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线称为色谱峰，峰的起点和终点的连接直线称为峰底。3．峰形正常的色谱流出曲线为对称于峰尖的正态分布曲线，如图(a)所示。但实际上，流出曲线并非完全对称，不正常的色谱峰有拖尾峰和前伸峰，如图(b)、(c)所示。色谱图及基本概念—色谱分离技术

4．保留值:表示混合物中各组分在色谱柱中停留时间或将组分带出色谱柱所需流动相体积的数值，称为保留值。保留值可作为定性分析的参数，由于计量单位的不同，分别称为保留时间、保留体积。（1）保留时间:从开始进样至柱出口处被测组分出现浓度最大值时所需的时间，称为保留时间（2）保留体积:从开始进样到柱出口处被测组分出现浓度最大值时所通过的流动相体积，称为保留体积。色谱图及基本概念—色谱分离技术（3）相对保留值:在相同的操作条件下，待测组分与参比组分的校正保留值之比，称为相对保留值，又称为选择因子。相对保留值可以消除某些操作条件对保留值的影响，只要柱温、固定相和流动相的性质保持不变，即使填充情况、柱长、柱径及流动相流速有所变化，相对保留值仍保持不变。色谱图及基本概念—色谱分离技术5．峰高与峰面积色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高，用h表示；峰与峰底之间的面积称为峰面积，用A表示，可作为定量分析的参数。6．区域宽度

色谱峰的区域宽度/可衡量柱效，并且可与峰高相乘/来计算峰面积，如图所示.在理想的色谱中，组分的谱带应是很窄的，若谱带较宽，将直接导致分离效果下降。色谱图及基本概念—色谱分离技术7．分离度R分离度R是指:相邻两色谱峰保留值之差与两组分色谱峰峰底宽度平均值之比值.分离度R综合考虑了保留值的差值与峰宽两方面的因素对柱效率的影响，可衡量色谱柱的总分离效能。色谱图及基本概念—色谱分离技术7．分离度R

根据分离度R的大小可以判断被物质在色谱柱中的分离情况；R值越大，两色谱峰的距离越远，分离效果就越好，如图所示。当R<1时，两峰有部分重叠；当R=1时，两峰有98%的分离；当R=1.5时，分离程度可达99.7%；一般用R=1.5作为相邻两峰完全分离的标志。色谱图及基本概念—色谱分离技术8．柱效

柱效是表达色谱柱性能的一个重要参数，可用塔板数N和塔板高度H表示。9．色谱流出曲线的意义

色谱峰数等于样品中单组分的最少个数；色谱保留值是定性分析的依据；色谱峰高或面积是定量分析的依据；色谱保留值或区域宽度是色谱柱分离效能的评价指标；色谱峰间距是固定相或流动相选择是否合适的判定依据。药物分离与纯化技术课程色谱分离技术-阻滞因数及塔板理论阻滞因数及塔板理论-色谱分离技术大纲1.阻滞因数或比移值Rf2.新型分离与纯化技术的研究和开发阻滞因数及塔板理论-色谱分离技术在色谱柱（纸、板）中，溶质的移动速度与流动相的移动速度之比，称为阻滞因数或比移值Rf，其定义式可写为：1.阻滞因数或比移值Rf阻滞因数及塔板理论-色谱分离技术

令As为固定相平均截面积，Am为流动相平均截面积，则系统或柱的总截面积At=As+Am。设体积为V的流动相流过色谱系统，流速很慢，可以认为溶质在两相间平衡，则：1.阻滞因数或比移值Rf因此，当Am、As一定时（与装柱时的紧密程度有关），一定的平衡系数K有相应的Rf值。阻滞因数及塔板理论-色谱分离技术塔板理论源于精馏，是Martin将其引入色谱的。

塔板理论假设：色谱柱的内径和柱内的填料是均匀一致的，混合液流经一小段色谱柱后，各组分在两相间达平衡。这一小段色谱柱可看成是一个理论塔板，相当于精馏操作中的一块理论塔板，一个理论塔板所对应的色谱柱的长度称为理论塔板高度（理论板高），一个色谱柱可包含若干个理论塔板。2.塔板理论阻滞因数及塔板理论-色谱分离技术理论塔板本身是个虚拟的概念，但是理论塔板数的多少可反映色谱柱分离性能的优劣。

单位长度色谱柱内包含的理论塔板数越多，流动