2株大肠埃希菌中发现ndm-1耐药基因

2株大肠埃希菌中发现ndm-1耐药基因

新修订的金属-内酰胺酶1（ndt-1）可从大多数内酰胺类抗生素中分解，包括目前最有效的碳青霉烯类抗生素，这将导致细菌的严重耐药性。这些药物的抗生基因也可以通过颗粒传递。我国卫生部于2010年10月25日开始要求各医疗机构筛查和监测含NDM-1基因的菌株。海南省人民医院检验科在2株大肠埃希菌中发现NDM-1基因,现将结果报告如下。1体外药敏试验结果2012年海南省人民医院检验科自住院患者标本中分离的2株对亚胺培南和美罗培南体外药敏试验结果均为耐药的大肠埃希菌,1株分离自痰液,另1株分离自清洁中段尿。1.4金属内酰胺酶检测取过夜培养待测菌落,用无菌生理盐水调至0.5麦氏浊度单位的悬液。将菌液均匀涂布于M-H琼脂平板,干燥后将亚胺培南纸片(每片10μg)置于涂菌平板表面,距其1.5cm处贴亚胺培南+EDTA(含有0.185mgEDTA10μL)纸片,35℃培养16~18h判读结果。亚胺培南+EDTA纸片抑菌圈直径比亚胺培南纸片>5mm为产金属β-内酰胺酶。取过夜培养待测菌落,用无菌生理盐水配成0.5麦氏浊度单位的悬液,将菌液均匀涂布于M-H琼脂平板上,静置10min待干燥。将IP/IPIE-test试条置于涂菌平板表面,35℃培养16~18h判读结果。IP/IPI>8为阳性。将培养16~18h的新鲜培养物混悬于100~200μL无菌去离子水中,沸水浴10min,12000r/min离心5min,取上清,-20℃保存。2株NDM-1阳性的大肠埃希菌为供体菌,大肠埃希菌J53为受体菌,各制成0.5麦氏浊度单位菌悬液,供体菌和受体菌按比例为1∶10混匀,35℃培养4h后涂布血平板,35℃培养18h后用生理盐水洗下平板上的细菌,调至0.5麦氏浊度单位后涂布含100mg/L叠氮钠和1mg/L亚胺培南的麦康凯平板,培养48h后观察结果。麦康凯平板上长出的红色扁平菌落用API20E细菌鉴定条和Vitek2微生物分析系统进行药敏试验,然后用NDM-1特异性引物扩增后产物测序进行确认。2nd-1的生物酶基因测序两株菌亚胺培南/亚胺培南+EDTA纸片法和IP/IPIE-test试条法协同试验均阳性,均产生金属碳青霉烯酶。2株试验菌株均扩增出初筛NDM-1基因和全长NDM-1基因目的条带,见图1。测序结果分别在BLAST与FN396876.1进行比对分析,同源性为100%。NDM-1是一种新发现的金属β-内酰胺酶,属于碳青霉烯酶Ambler分子分类中的B类(金属β-内酰胺酶)。该酶不仅具有其他金属β-内酰胺酶的相同特性,即能水解几乎所有β-内酰胺类药物(氨曲南除外),同时携带NDM-1基因的菌株常对喹诺酮类、氨基糖苷类等非β-内酰胺类抗菌药物也呈现交叉耐药,仅对替加环素和多黏菌素敏感。2010年英国、印度、巴基斯坦、瑞典和澳大利亚等国学者进行的一项研究表明,在印度、巴基斯坦和英国共分离得到180株含有NDM-1质粒基因的细菌,说明NDM-1基因开始小规模扩散本实验室此次分离出的2株大肠埃希菌除了对多黏菌素B和替加环素敏感外,对β-内酰胺酶加抑制剂、头孢类、碳青霉烯类、氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物呈现高水平耐药,这与Kumarasamy等1.1蘑菇1.2细菌鉴定及药敏质控Vitek2全自动细菌鉴定仪、API20E生化鉴定条和配套GNS药敏卡(法国生物梅里埃公司),亚胺培南、美罗培南、替加环素和IP/IPIE-test试条(瑞典ABBiodis公司),亚胺培南纸片(每片10μg,英国Oxoid公司),D2000DNAmarker(北京天根公司),2×TaqPCRMasterMix(北京百泰克公司),大肠埃希菌J53(叠氮钠抗性,复旦大学华山医院抗生素研究所徐晓刚教授赠予),细菌鉴定及药敏质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922(购自卫生部临床检验中心)。E-CycleTM96PCR扩增仪(北京博奥公司),琼脂糖电泳仪(北京六一仪器厂),JS-380自动凝胶成像系统(上海培清公司)。1.3最低抑菌浓度mic值的测定细菌鉴定使用API20E生化鉴定条,具体方法按照说明书操作。亚胺培南、美罗培南和替加环素体外药敏试验用浓度梯度法(E-test试条法)测最低抑菌浓度(MIC)值,其他药物MIC值用Vitek2全自动细菌鉴定仪和配套GNS卡进行检测。替加环素药敏结果判定按照美国食品药品管理局(FDA)的肠杆菌科判断标准:MIC≤2μg/mL为敏感;其他药物测得的MIC值以2012年CLSI的临界值1.4.1亚胺培南组亚胺培南组及亚胺培南组的联合试验1.4.2ip测试与合作开发法的一致性试验1.5细菌dna提取1.6mm76.1设计NDM-1基因初筛和全长引物参考GenBank中FN396876.1设计,由上海生工公司合成,见表1。反应体系为50μL,包括2×TaqPCRMasterMix25μL,上、下游引物各1μL、DNA模板1μL,无菌ddH1.7同粒试验2.1产金属碳青霉烯酶表型测定2.2pcr扩展和过程研究的结果2.32e.colij65检测药