手动细胞计数标准操作规程

1/4所属类别：稳定细胞株部文件编号：ACRO/QMS/SOP/SCL-19文件名称：手动细胞计数标准操作规程生效日期：2017.2.28编制：王薇编写日期：2016.04.20批准人职位：部门主管批准人：批准日期：2017.2.28文件类别：SOP页数：4版本号：1.3控制级别：控制文件1目的规范手动细胞计数的标准操作程序。2适用范围用于常规工程细胞（CHO、293E、293F等）手动细胞计数。3适用责任本文件适用于细胞实验室所有人员。4基本原理4.1计数室边长为1mm（400个小方格组成），则计数室面积为1mm2。盖上盖玻片后计数室高度0.1mm，所有每个计数区体积为0.1mm3。具体示意图如下：4.2一般计数293、CHO等常规细胞系，平均单个大方格中的细胞数量×悬液稀释倍数/10-4即可算出每毫升中细胞个数即细胞密度。5仪器设备倒置生物显微镜、细胞计数板和盖玻片、计数器、漩涡震荡仪、移液枪及配套枪头6试剂耗材0.4%台盼蓝溶液、1×PBS、超纯水、无水乙醇；7操作程序7.1准备工作7.1.1打开显微镜电源、漩涡震荡仪电源；7.1.2按倒置荧光生物显微镜标准操作流程，对计数板计数室进行镜检，若有污物，则需要重新清洗、风干，盖好盖玻片准备计数；7.2细胞悬液计数7.2.1贴壁培养细胞，按贴壁细胞传代的标准操作流程制备单细胞悬液。悬浮培养细胞，则将细胞悬液混合均匀后取0.5ml用于EP管中计数。7.2.2将细胞悬液于漩涡震荡仪上震荡混匀；7.2.3均匀取50ul细胞悬液于另一EP管中，再补加适量体积的0.4%台盼蓝，于漩涡震荡仪上震荡混匀；7.2.4均匀取10ul细胞悬液，加样至盖玻片和计数板之间（若有加样槽，加至加样槽中），利用毛细管现象和液体表面张力使液体充满计数室。（注：悬液加入量以不超过计数室台面和盖玻片间的矩形边缘为宜；如果有可见气泡或液体溢至矩形边缘，需要将计数板清洗擦拭干净后重新加样）7.2.5静置半分钟，将计数板放置显微镜载物台上，按倒置生物显微镜标准操作流程在镜下找到计数室；7.2.6用计数器记录计数区域中活细胞个数和死细胞个数；（注：计数区由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格的细胞数。若细胞体位于中方格的双线上，计数时则数上不数下，数左不数右，以减少误差。）7.3细胞密度计算数n个大方格中细胞数量/n×悬液稀释倍数/10-4即可算出每毫升中细胞个数即细胞密度。7.4计数后整理使用完毕，取下盖玻片于计数板一起用超纯水冲洗干净，用无水乙醇脱水风干后放入盒中保存。显微镜按倒置生物显微镜标准操作流程归置原位，关闭电源。8注意事项8.1对计数板清洗擦拭过程中，勿用硬物洗刷，以免破坏网格刻度，清洗后最好自行晾干，或用柔软的擦镜纸轻微擦干；通过镜检确定每小格内是否有残留菌体及染液沉淀物，若不干净，必须重复洗涤直到干净为止。8.2每个大方格控制在50个细胞为宜，计数误差比较小。若每大格中细胞个数较多，可用工作浓度PBS将细胞悬液稀释后计数。8.3向已经盖上玻片的计数板中加样品，从某一点进样需一次性完成，流速要均匀，不可向下按压盖玻片。若有气泡或镜检计数板中细胞分布明显不均匀，需要清洗计数板，重悬加样。修订时间变更内容变更后版本号修订人2015.3.13更改排版1.1王薇2016.5.1表头格式修改1.2石洋华2017.2.25公司Logo更新1.3张雅慧编制