DIG试剂盒说明书(CSPD)中文翻译版讲解

#只用于生命科学研究，不能用于诊断程序仅用于体外实验DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKit采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用CSPD化学发光检测，随时即用。货号：11585614910此试剂盒储存条件：-15C到-25C。此试剂盒可对10ng-3“gDNA进行12次标记反应，可检测10x10cm2面积的杂交膜24张。指导手册2005.12版1前言1.1内容表1前言1.1内容表1.2试剂盒成分介绍2.1产品简介操作步骤和所需材料3.1在你开始前3.2流程图3.3地高辛标记DNA标记效率的确定DNA的转移和固定杂交免疫检测DNA印记的洗脱和再杂交附录故障排除参考文献订购信息1.2试剂盒的成分瓶号标记内容包括功能1DIG-高效引物50mL地咼辛标记的咼效引物5X浓度的标记混合物:优化的浓度的随机引物，核昔酸，地高辛标记的dUTP（碱标记的），Klenow酶和缓冲液成分随时可用澄清的粘液用于DNA的高效随机引物标记

2DIG标记的对照DNA20uL5卩g/mL质粒pBR328DNA（用BamHI线性化）澄清溶液用于确定标记效率3DNA稀释缓冲液3管1mL50卩g/mL鱼精DNA,10mMTris-HCl,lmMEDTA,pH8.0在25°C澄清溶液4抗地高辛的碱性磷酸酶结合物50uL750U/mL从羊中获取的，Fab段，结合碱性磷酸酶澄清溶液5CSPD随时可用50mLCSPD澄清溶液6封闭液4X100mL

10X浓度黄色，粘液7地高辛杂交颗粒100mL地高辛杂交液共4瓶，用于DNA杂交附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。在每个操作程序的前面提供了详细的信息操作程序仪器设备试剂3.3DIG-DNA标记水浴灭菌的双蒸水0.2MpH8.0灭菌的EDTA3.4标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜*地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液

3.5DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设备20XSSC或者10XSSC3.6杂交尼龙膜，带正电荷*杂交袋*,或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶注意：当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。3.7免疫检测耐热的塑料袋或者滚筒瓶杂交袋*地高辛洗涤和封阻缓冲液组合*，或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液3.8DNA斑点的脱色和重新标记探针大的托盘水浴10XSSC10%SDS0.2MNaOH

*标记的产品可以从RocheAppliedScience获得。2.介绍2.1产品概况实验原则此试剂盒采用DIG（地高辛），一种甾类半抗原，steroidhapten去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测［1,2,3］。步骤描述DNA标记根据随机引物标记技术采用地高辛标记引物获得了地高辛标记的DNA探针。地咼辛标记的咼效引物是一种专门生产的反应混合物，其中含有地咼辛dUTP，碱性标记（图1）和所有的试剂，包括随机引物标记所必须的酶，已预先混合优化的5X浓度反应缓冲液。杂交根据标准方法，地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。采用碱标记形式的地咼辛11dUTP能够更加容易和有效的被洗脱下来，使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂交。免疫检测杂交探针可以用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫检测，Fab段，然后采用即时可用的化学发光底物CSPD可以看到杂交结果。采用碱性磷酸酶可以对CSPD进仃，酶的脱磷酸化，导致在取大波长477nm处有光的发射（图2）,这一现象可以用适合的图像仪或者X光片进行记录。胶片的曝光时间范围只在5-30分钟内。图1DIG-dUTP，碱性标记图2CSPD反应应用地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物体也可以进行检测，如人，大麦和小麦。样品材料至少100bp的DNA片段线性的质粒，cos质粒或者DNA超螺旋的DNA实验时间此表格列出了每一步实验所需的反应时间。步骤反应时间DNA标记1小时-过夜杂交6小时或者过夜免疫检测1.5小时测化学荧光信号检5-30分钟检测数量一个试剂盒足够用于:12个标准的标记反应，每个反应的膜板DNA不超过3ug；并可以检测24张10X10cm2的杂交膜。质量控制根据操作步骤中的说明对未标记的对照DNApBR328进行标记，

并按照下面的标准检测操作方法在点杂交中用50ng的异源的DNA稀

释0.1pg同源DNA，用即时可用的CSPD,X光片曝光30分钟进行检测。试剂盒的储存和稳定性未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在T5°C到-25°C（保质期印在标签上）。在干冰中运输。一旦开封，请根据下表选择适宜的储存条件。试剂盒成分储存条件抗地高辛碱性磷酸酶结合物（4号管）2-8C稳定。注意：不要冻存

CSPD随时即用（5号管）2-8°C，避光保存。圭寸阻液（6号管）未开封时15C25C稳定。旦开封，应分装并储存在-15C到-25C或者无菌条件下2-8C间可以稳定保存1个月。工作溶液都应是新鲜配制的。地高辛杂交颗粒储存在15C-25C旦开封，无菌条件下溶液可以稳定存在1个月。地高辛高效引物混合物保质期12个月，-15C到-25C。避免反复冻融。灵敏度和特异性采用southern杂交从0.3ug人胎盘DNA（经BglII或EcoRI酶切）中检测到单拷贝基因（组织纤溶酶原激活因子tPA）。优点此表描述了这个试剂盒的优点和特征优点特征精确、快速预先已混好的地高辛高效引物混合物减少了标记DNA时手动操作的时间，同时提高了产量，重复性好灵敏在复杂的总人DNA及植物基因组中能够检测到单拷贝基因。

省时地咼辛标记的探针可以至少储存一年。杂父溶液可以重复利用3-5次，重复次数主要取决于每次杂交中产生信号的标记探针的量。3．实验步骤和所需材料在你开始前主要的操作要求此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示：要求指引在清洁的条件下进行操作咼压灭菌地咼辛系统的试剂过滤灭菌的溶液包括：SDS,吐温20,并应该加入到已灭菌的溶液中。用干净的孵育托盘每次使用前都要严格地清洗实验托盘处理膜的要求带无粉手套处理膜的时候，只能够用干净的镊子夹膜的边缘流程图

3.3部分地高辛标记DNA3.4部分标记效率的检测3.5部分DNA固定3.6部分杂交3.7部分免疫检测3.8部分洗脱和DNA斑点与另一探针的杂交地高辛标记DNA介绍随机引物标记的DNA带有地高辛-11-dUTP,这一标记采用的是地高辛高效引物试剂，这是一种含有随机六碳糖，dNTP混合物的5X浓度标记混合物，其中dNTP混合物包括碱性标记的地高辛-11-dUTP,

标记级的Klenow酶和适合的反应缓冲液。附加设备和所需试剂此表中列出了成分，储存条件和除了试剂盒成分外所需试剂的用途。溶液成分储存条件/稳定性用途水咼压灭菌的双蒸水15-25°C，稳定稀释DNAEDTA（乙二胺四乙酸）0.2MEDTA,pH8.015-25°C，稳定终止标记反应模板DNA下表中列出了模板DNA所需特征:特征详细信息纯度模板DNA应该采用theHighPurePlasmidIsolationKit进行制备。当采用其他商业化的纯化试剂盒进行纯化时，我们建议额外进行次苯酚/氯仿抽提以去除残余的蛋白质。

在标记之前如果对模板进行限制酶切或者其他酶的修饰作用，那么此步骤也是需要进行的。大小为了获得理想的结果，模板DNA应该线性化，且大小应该在100bp以上。如果模板DNA大于5kb，那么在标记之前应该采用限制性酶切序列为4个核苷酸的限制性酶（如HaeIII）对模板进行酶解。数量上面步骤描述原则上10ng-3ug的模板均可以标记上，然而请仔细查看在给定的表中，用于你的杂交实验所需的探针。可以根据提供的操作方法放大总体积和成分用量来获得更大量的标记探针。如果要检测复杂基因组中的单拷贝基因，需标记的模板DNA用量至少300ng（探针浓度：25ng/mL杂交液）。标记从琼脂糖凝胶上分离的DNA如果你想要完成基因组的southern杂交，你应该利用琼脂糖凝胶电泳将插入载体的模板DNA从载体上分离出来。为了从凝胶中分离DNA，你可以用琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒（theAgaroseGelDNAExtractionKit）进行大小在400bp-5kbp范围内DNA片段的回收。这一试剂盒既可以用于标准琼脂糖凝胶也可用于低熔点琼脂糖凝胶。然后，不需要进一步纯化即可对DNA片段进行高效的地高辛标记然后标记好的探针应该用高效的PCR产物纯化

试剂盒（HighPurePCRProductPurificationKit）进行纯化以去除残留的琼脂糖颗粒。步骤此步骤用于标记10ng-3ugDNA。可以通过扩大所有成分和体积标记更大量的DNA（最高达10ug）。步骤操作1向一个反应管仲中加入lug模板DNA（线性或超螺旋）和高压灭菌的双蒸水，终体积达16uL。2沸水浴10分钟以变性DNA,然后迅速插入冰水混合物中。注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。3充分混合DIG-HighPrime（1号管），并取4uL加入到变性DNA中，混合并简单离心。37°C孵育1小时或者过夜。注意：较长的孵育时间（最高达20小时）能够提高地高辛标记DNA的产量（见下表）4加入2uL0.2MEDTA（pH8.0）和/或65C加热10分钟终止反应。

注意：采用地咼辛咼效引物获得的地咼辛标记片段的长度范围可以从200bp到1000bp甚至更长，这主要取决于原始模板DNA的长度。标记反应的产量表1：此表向您展示了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。在标准反应中每个实验采用lugDNA作为模板。1小时内，大约有15%的核苷酸参与到了0.8ug新合成的地高辛标记DNA中。20小时后消耗了大约38%的核苷酸。模板DNA1h20h10ng45ng600ng30ng130ng1050ng100ng270ng1500ng300ng450ng2000ng1000ng850ng2300ng3000ng1350ng2650ng使用DIG-High-Prime溶液，增加不同模板DNA的量进行反应，并检测反应1小时和反应20小时的差异。地高辛标记DNA的产量由放射线示踪器进行测定，并通过斑点杂交进行证实（10个独立标记实验的平均值）。图3来自于不同量模板DNA的地高辛标记DNA在37°C孵育1小时和20小时后的产量标记效率的确定介绍地高辛标记DNA产量的确定对于获得最佳的，具有可重现性的杂交结果十分重要。在杂交混合物中探针浓度过高容易产生背景，而太低浓度则容易导致信号弱。实验原则检测标记探针质量的好方法是直接检测法。步骤描述1将地高辛标记DNA的一系列稀释梯度点到一小块带正电荷的尼龙膜上。尼龙膜部分区域已经点好一系列稀释梯度的地高辛标记的对照DNA（2号管）作为标准。2采用anti-DIG-AP结合物（4号管）和随时即用的CSPD对尼龙膜进行免疫检测。所需附加溶液的制备

请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液无DNA酶和RNA酶系列产品中获得。请注意：标记效率确定实验中检测部分所需的试剂和工作试剂应与你的杂交实验（请看3.7章）中化学发光检测使用的试剂一致。这些试剂可以大量制备，在第3.7章中也将用到。溶液成分/制备储存/稳定性用途洗涤缓冲液0.1M马来酸0.15MNaClpH7.5(20°C)0.3%(v/v)Tween2015-25C，稳定去除未结合的抗体马来酸缓冲液0.1M马来酸0.15MNaCl用NaOH(固体)调节pH值到7.5(20C)15-25C，稳定封阻液的稀释检测缓冲液0.1MTris-HCl0.1MNaClpH9.5(20C)15-25C，稳定调整pH值到9.5

试剂盒工作溶液的制备下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法溶液成分/制备方法储存/稳定性用途封阻溶液用马来酸缓冲液按照1:10的比例将10X封阻液（6号管）稀释成IX工作溶液一直新鲜制备封阻膜上非特异结合位占抗体溶液每次使用前将原始管仲的anti-digoxigenin-AP（4号管）10000rpm离心5分钟。然后从表面小心吸取所需用量。用封阻溶液按照1：10000（75mU/mL）的比例稀释anti-digoxigenin-AP2-8°C,12h与地高辛标记的探针结合稀释系列根据合成核苷酸的预期产量开始下面的的系列稀释，标记的探针和地高辛标记的对照DNA（2号管）应该稀释到Ing/uL。利用第3.3章中图表可以最好的估计出在你的探针中地高辛标记DNA的预期产量。产量取决于起始时的模板量和孵育时间。注意：表1中给出的