药物毒理学原则及注意事项-周宗灿

药物毒理学原则

及注意事项北京大学医学部毒理学系

周宗灿电话：（010）82801531

第一页，共六十一页。药害事件1937年美国发生磺胺酏中毒事件，由于使用了二甘醇作为溶媒，引起107人服药后因急性肾衰竭而死亡。美国于1938年通过了CopelandBill法，要求药物必须安全。1959～1961年，西德、欧洲其他国家和日本等国发生发生反应停（thalidomide）致畸事件，新生儿四肢发育不全的严重畸形高达万例，引起极大的震动。1962年美国通过Kefauver-Harris修正法对药物临床试验要求更为严格，并要求对1938年至1962年间上市的所有药物逐一再评价，淘汰不安全和无效的药物和制剂。各国对药物的开发、生产与使用等加强了管理和监督。加强对药物的致畸研究。第二页，共六十一页。优良实验室规范(GoodLaboratoryPractice,GLP)1975年和1976年，美国FDA，对某些实验室安全性评价的毒理学资料进行调查后发现，在实验设计、研究实施及研究报告等方面都存在一些不能接受。FDA和EPA在对IBT(美国工业实验室)进行过的安全性研究的化学物和药物的审查中，EPA发现801项重要研究中，594项无效，占75%；FDA发现66项重要研究中24项无效，占36%。FDA1978年，EPA1980年颁布了GLP规范。之后OECD、EEC及许多国家也相继确立了GLP原则。GLP现已成为毒理学研究资料在国际间互相认可的共同要求。第三页，共六十一页。100,000个新化合物临床前评价100个进行人体试验10个进入市场●●2个药物得到回报新药开发成功率第四页，共六十一页。2描述毒理学试验的基本原则○化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人。○实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需的和可靠的方法。○成年的健康（雄性和雌性未孕）实验动物和人可能的暴露途径是基本的选择。第五页，共六十一页。检测和评价

人拟用剂量100倍↓↓药物A┕──────────────┘30倍毒性作用↓↓药物B┕────┘∴毒性无毒性毒性作用B>A

作用第六页，共六十一页。毒性评价试验的基本目的○受试物毒作用的表现和性质○剂量-反应(效应)研究○确定毒作用的靶器官○确定损害的可逆性第七页，共六十一页。毒理学试验19、急性毒性试验资料及文献资料。20、长期毒性试验资料及文献资料。3个月21、动物药代动力学试验资料及文献资料。22、致突变试验资料及文献资料。23、生殖毒性试验资料及文献资料(I,II,III段)24、致癌试验资料及文献资料。25、免疫毒性和/或免疫原性研究资料及文献资料。26、溶血性和局部（血管、皮肤、粘膜、肌肉等）刺激性等主要与局部、全身给药相关的特殊安全性试验研究和文献资料。27、复方制剂中多种组份药效、毒性、药代动力学相互影响的试验资料及文献资料。28、依赖性试验资料及文献资料。第八页，共六十一页。物种选择○急性毒性试验常用大鼠、小鼠、狗○长期、慢性毒性试验常用大鼠、狗、猴○皮肤刺激试验和致敏试验常用豚鼠○皮肤刺激试验和眼刺激试验常用兔○遗传毒理学试验多用小鼠○致畸试验常用大鼠、小鼠和兔○致癌试验常用大鼠和小鼠○迟发性神经毒性试验常用母鸡第九页，共六十一页。染毒途径毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人在接触该受试物的方式。最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮途径。第十页，共六十一页。溶剂和赋型剂染毒前根据染毒途径的不同，应将受试物制备成一定的剂型。常用的是制备成水溶液、油溶液或混悬液。对溶剂和助溶剂的要求是：①所用的溶剂或助溶剂应该是无毒或实际无毒②与受试物不起反应，受试物在溶液中应稳定；③无特殊刺激性或气味；④对受试物的毒动学和毒效学无显著影响。第十一页，共六十一页。溶剂和赋型剂对水溶性受试物，体内试验首选的溶剂为水（经口染毒）和等渗盐水（胃肠道外染毒）。水不溶性受试物应溶于或悬浮于适当的有机溶剂中。混悬液最常用的赋形剂为0.5%羧甲基纤维素钠或10%阿拉伯树胶。受试物溶液应新鲜配制，除非已证明贮存稳定。第十二页，共六十一页。美国药剂协会（1986）推荐的常用溶剂和赋型剂1。丙酮（Acetone）；2．羧甲基纤维素（Carboxylmethylcellulose，CMC）；3．玉米油（Cornoil）；4．二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide,DMFO）；5．二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide,DMSO）；6．乙醇（Ethanol）7．（Glycerol）甘油；；8．阿拉伯胶（GumArabic）；9．乳糖（Lactose）；10．甲基纤维素（Methylcellulose）11．甲基乙基酮，丁酮（Methylethylketone，MEK）；12．凡士林油（Mineraloil；liquidpetrolatum）；13．橄榄油（Oliveoil）；14．花生油（peanutoil/Arachisoil）15．凡士林（Petrolatum/Vaseline/petroleumJelly）；16．聚乙二醇-400（PolyethyleneGlycol-400，PEG400）；17．生理盐水（Saline）；18．吐温80（Tween80）；19．水（Water）（黄色示可用于经口）第十三页，共六十一页。一般推荐的染毒最大容积（1）经口20ml/kg（对空腹动物）；（2）经皮2ml/kg（根据体表面积计算，限于染毒的准确性）；（3）静脉1ml/kg（5分钟以上）；（4）肌肉注射0.5ml/kg（一个部位）；（5）每眼0.01ml；（6）直肠0.5ml/kg；（7）阴道：大鼠0.2ml,兔1ml；（8）吸入2mg/L；（9）鼻：猴或犬每鼻孔0.1ml。第十四页，共六十一页。急性毒性试验急性毒性是指实验动物一次接触或24小时内多次接触某一化学物所引起的毒效应，甚至死亡。急性毒性试验的目的：1.评价化学物对机体的急性毒性的大小、毒效应的特征和剂量-反应（效应）关系，并根据LD50值进行急性毒性分级。2.为长期、慢性毒性研究及其它毒理试验接触剂量的设计和观察指标的选择提供依据。3.为毒作用机制研究提供线索。第十五页，共六十一页。经典急性致死性毒性试验实验动物，一般是在小鼠、大鼠等染毒途径应模拟人可能的接触途径。经口灌胃、吸入、经皮、其它（注射等）。在利用不同的方法计算化学物LD50时，实验设计中对剂量设计和动物数的要求不同。急性致死性毒性试验可以不设阴性对照组。染毒后一般要求观察14天。观察实验动物的中毒症状和死亡。化学物给实验动物染毒后，动物往往出现兴奋

抑制

死亡，或者抑制

死亡的现象。第十六页，共六十一页。五种化合物的LD50值的实验室间变异化合物 范围（mg/kg）比值(最大/最小)五氯酚 74~620* 8.38水杨酸钠 930~2328 2.50苯胺 479~1169 2.44乙酰苯胺 723~3060 4.23氯化镉105~4824.59（1977年欧洲共同体13个国家的100个实验室）第十七页，共六十一页。急性毒性试验的其它方法

固定剂量法（fixeddoseprocedure）急性毒性分级法（acutetoxicclassmethod）上、下法（up/downmethod）或阶梯法，限量试验。如受试物的毒性很低，可用限量试验。一般啮齿类（大鼠或小鼠）20只，也有用10只，雌雄各半。单剂染毒剂量不超过5g/kg体重.第十八页，共六十一页。欧洲共同体的急性口服毒性分级标准高毒（VeryToxic，LD50

25mg/kg）有毒（Toxic，LD50为25～200mg/kg）有害（Harmful：LD50为200～2000mg/kg）不分级（Unclassified，LD50

2000mg/kg）四个等级第十九页，共六十一页。研究慢性毒性的必要性利用急性毒性试验的资料难以预测慢性毒性外源化学物在长期重复染毒时可产生与急性毒性试验完全不同的毒作用。如苯急性中毒引起中枢神经系统抑制，而长期反复接触可引起粒细胞缺乏及白血病。随着动物的衰老，有些因素如组织易感性改变、代谢和生理功能的改变，以及自发性疾病等均可影响毒作用的性质和程度。某些重要的疾病例如心脏病、慢性肾衰、肿瘤等均与年龄的增长有关。第二十页，共六十一页。长期毒性试验期限长毒给药期限药物临床疗程啮齿类非啮齿类支持的临床研究2周~1个月1个月1个月II期3个月3个月III期（生产）≤3个月3个月3个月II期6个月6个月III期（生产）≤6个月6个月6个月II期6个月9个月III期（生产）＞6个月6个月9个月II期6个月9个月III期（生产）第二十一页，共六十一页。长期毒性试验·实验动物和分组○啮齿类动物，首选大鼠，每组至少20只动物。.非啮齿类动物，狗、猴，每组至少6--8只动物。雌雄各半。○随机分为4组，即高、中、低3个剂量组和1个对照组，每组至少20只动物，雌雄各半。○剂量选择：最高剂量组应出现毒性效应，动物死亡不超过10%。理想的中间剂量，应产生最小可观察到的毒性效应；低剂量组应不引起任何毒性效应。○另设阴性（溶剂）对照组。第二十二页，共六十一页。长期毒性试验·试验方法○一般采用灌胃方式经口染毒，每天灌胃一次。或经饲料、饮水染毒。○动物每周称体重，并按体重调整给予的受试物剂量。○吸入途径或经皮途径。○大鼠试验期为3个月(90天)。第二十三页，共六十一页。长期毒性试验·观察指标(1)一般表现。每天观察动物中毒表现，死亡情况，每周称量体重一次。于实验结束时进行血液学和生物化学检查。(2)血液学检查。血红蛋白含量、红细胞数、白细胞及其分类计数、血小板数、网织红细胞数等。10项(3)生物化学检查。侧重于反映肝、肾功能指标，如血清天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐、总蛋白和白蛋白、血糖、总胆固醇、总胆红素等。钾钠氯等。16项(4)尿液分析指标:8项,非啮齿类第二十四页，共六十一页。长期毒性试验·观察指标(4)脏器重量。测量心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、睾丸、卵巢、脑等的脏器重量和脏/体比。(5)病理学检查。进行尸检，并将主要器官和组织（33种）固定、保存。当各剂量组动物尸检未发现明显病变时，只进行高剂量组和对照组动物的组织病理学检查，如发现病变再对中、低剂量组动物相应的器官进行组织病理学检查。第二十五页，共六十一页。长期毒性试验

外观┐长期、慢性生长发育(体重)├毒性试验体液行为│过程中•血液学毒性体征┘↓•血清生化学活杀解剖•尿分析最终体重┐↓脏器湿重├器官/组织生物学标志脏/体比┘↓•酶固定/染色•内源性成分组织病理学•胆汁、尿第二十六页，共六十一页。长期毒性试验·评价○数据以均数和标准差表达。○各试验组与对照组比较，进行统计学检验。○注意评价剂量-反应关系，评定LOAEL和NOAEL及毒作用靶器官。第二十七页，共六十一页。遗传损伤分类根据DNA改变涉及范围的大小，遗传损伤分为三大类：○基因突变○染色体畸变○基因组突变第二十八页，共六十一页。遗传毒理学试验遗传毒理学试验的主要目的是：①研究外源化学物引起人类生殖细胞的突变并传递给后代的可能性；②用于外源化学物潜在致癌性的预测。判断哺乳动物性细胞致突变物的标准体内试验是小鼠特异座位试验和小鼠可遗传易位试验。遗传毒理学试验检测的遗传学终点分为四类，即基因突变、染色体畸变、非整倍体、DNA损伤。第二十九页，共六十一页。遗传毒理学试验成组试验组合原则

应包括多个遗传学终点。现在还没有一种试验能同时检测测全部遗传学终点。2)试验指示生物包括若干进化阶段的物种，包括原核生物和真核生物。3)应包括体外试验和体内试验。一般认为，体外试验检测受试物本身是否具有遗传毒性，体内试验可确定受试物能否在体内显示其遗传毒性。第三十页，共六十一页。（ICH）对于药品的遗传毒性筛选国际协调组织（ICH）（1997）对于药品的遗传毒性评价建议的检测试验组合为1）细菌基因突变试验；2）体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细胞tk试验；3）体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验（骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验）。在对经标准试验组合得到的致突变作用结果进行进一步研究时，其他试验如DNA加合物测定、DNA链断裂检测、DNA修复和重组试验等都可作为供选择的试验。第三十一页，共六十一页。致癌物初步筛选方案结果和解释体外基因体内染色体畸变突变试验或微核试验说明

十十预测为遗传毒性致癌物一十预测为遗传毒性致癌物一一预测为非遗传毒性非致癌物十一需进一步试验第三十二页，共六十一页。生殖毒性○生殖毒性指对亲代雄性和雌性生殖功能的损害及对后代的有害影响。○生殖毒性可发生于妊娠前期、妊娠期和哺乳期。○生殖毒性表现为外源化学物对亲代生殖过程的影响，例如生殖器官及内分泌系统的变化，对性周期和性行为的影响，以及对生育力和妊娠结局的影响等。第三十三页，共六十一页。发育毒性○发育毒性指子代在到达成体之前对诱发的任何有害影响，包括在胚期和胎期诱发或显示的影响，以及在出生后诱发和显示的影响。○发育毒性主要表现：(1)胚胎死亡；(2)结构异常，即畸形；胚胎毒性(3)生长迟缓；(4)功能缺陷。

第三十四页，共六十一页。三段第三十五页，共六十一页。致畸试验·目的○检测受试物的致畸性○检测受试物的发育毒性，及其观察到有害作用的最低剂量（LOAEL）和末观察到有害作用的剂量（NOAEL）○检测受试物的母体毒性，母体毒性是指在致畸试验中化学物引起怀孕动物的毒效应，如：行为异常、体重不增或减少。第三十六页，共六十一页。致畸试验·动物和分组○试验用大鼠、小鼠、家兔。首选大鼠。○取健康、性成熟、未交配过的体重200～250g的雌性大鼠。○至少设4组，其中3个剂量组、阴性(溶剂)对照组，必要时设阳性对照组。每组至少12只孕鼠。○高剂量组剂量可用雌性动物LD50的1/10。低剂量组，可用雌性动物LD50的1/100。○心要时设阳性对照组，阳性对照常用敌枯双(1mg/kg体重)，维生素A(40000IU)，阿司匹林(300mg/kg体重)等。第三十七页，共六十一页。大鼠·致畸试验雄鼠×雌鼠阴栓

└┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┤（天）孕07←─染毒─→1620处死检查活胎、吸收胎、早死胎、晚死胎

┌─────┼─────┐大鼠外观畸形骨骼畸形内脏畸形第三十八页，共六十一页。(3)活胎检查。逐个记录活胎鼠性别、体重、体长、尾长。外观检查头面部、躯干部、四肢等有无外观畸形。(4)骨骼检查。每窝取约1/2～2/3活胎鼠，经茜素红溶液染色、透明。检查骨骼畸形，包括头骨、胸骨、脊椎骨、肋骨和四肢等有无骨化不全、迟缓和其他缺陷。(5)内脏检查。每窝取约1/2～1/3活胎鼠浸入固定液2周，作内脏检查。将胎鼠仰放石蜡板上。用刀片在头颈部常规共切5刀，再用剪刀剖开胸、腹腔，检查内脏畸形。致畸试验·检查第三十九页，共六十一页。致癌试验判断哺乳动物致癌物的标准体内试验○常用大鼠、小鼠。○动物随机分为4组，即3个剂量组和1个对照组，每组至少雌雄各50只动物。○实验周期大鼠24个月、小鼠18个月。○主要观察肿瘤发生率、潜伏期、肿瘤组织病理学。第四十页，共六十一页。WHO标准WHO(1969)提出机体可以对致癌物有下列一种或多种反应：1.对于对照组也出现的一种或数种肿瘤，试验组肿瘤发生率增加；2.试验组发生对照组没有的肿瘤类型；3.试验组肿瘤发生早于对照组；4.与对照组比较，试验组每个动物的平均肿瘤数增加。第四十一页，共六十一页。统计学意义和生物学意义是否有统计学意义-是否有生物学意义-是否是有害效应○在评价毒理学试验结果时，要综合评价实验结果的统计学意义和生物学意义○一般来说，具有统计学意义是具有生物学意义的必要条件之一。○正确地利用统计学假设检验的结果有助于确定实验结果的生物学关联。第四十二页，共六十一页。

统计学意义生物学意义无有无ⅠⅢ有ⅡⅣ毒理学试验结果的

统计学意义和生物学意义在此表中，第Ⅰ和第Ⅳ种情况最为常见。第四十三页，共六十一页。统计学意义和生物学意义第Ⅱ种情况是具有生物学意义但无统计学意义，这可能是因为该事件的发生是极端罕见的，例如在哺乳动物致癌试验中，在染毒组中出现对照组中没有的肿瘤类型，尽管从统计学上此种肿瘤的发生率很低，与对照组比较差别无显著性(P＞0.05)，但还应该认为是有生物学意义的。第四十四页，共六十一页。统计学意义和生物学意义○第III种情况是有统计学意义但无生物学意义，此种情况相当见。○在判断实验结果的生物学意义时，有无剂量-反应关系是关键。○有统计学意义但无生物学意义的情况，更常见的原因是因为实验设计不良所致。

第四十五页，共六十一页。判断生物学意义的步骤（1）纵向比较，此参数的改变有无剂量-反应关系。（2）横向比较，此参数的改变是否伴有其它相关参数的改变。（3）与历史性对照比较，同时进行的阴性对照应在历史性对照的均数±3SD范围之内，否则应重新试验。观察值与对照组比较，差别具有统计学显著性（P<0.05），其数值不在正常参考值范围之内属于有害作用。第四十六页，共六十一页。统计学意义和生物学意义○应重视在染毒早期可能出现一过性改变，如有剂量-反应关系可能为机体的适应，应分析其是损害作用。否则，可能无生物学意义。○如体重改变与对照组比较差别有显著性，但改变不超过10%，则无生物学意义。○脏器重和脏体比同时有统计学意义时，才认为有生物学意义。○有统计学意义但无生物学意义的参数过多（如10%以上），可能该实验的质量保证不佳。第四十七页，共六十一页。损害效应/非损害效应

当处理组数据与阴性对照组比较差别有显著性，并且经分析认为是与受试物处理有关的生物学效应，应进一步判断其为损害效应还是非损害效应。第四十八页，共六十一页。

长期毒性实验WBC计数与阴性对照组比较，—，P>0.05；+，P<0.05；++，P<0.01

剂量组实验1实验2实验3高剂量++－+LOAEL？中剂量+LOAEL+－NOAEL？低剂量－NOAEL－－第四十九页，共六十一页。以啮齿类和非啮齿类动物的资料预测人的毒性具有不确定性Lumley(1990)和Igarashi（1994）根据有限的临床资料报告对人的毒性约一半不能由临床前（动物）毒性研究预测。Heywood(1983)报告27个化学物（大多为药品）的靶器官毒性在大鼠和狗（或猴）之间的相符率仅20%。Olson等（1998，2000）报告131种化学物对动物的毒性与人的毒性相符率，啮齿类为45%，非啮齿类（狗和猴）为65%，合并达73%。第五十页，共六十一页。被评为致癌物的化学物比例（Ames等，2000）在R和M测试的化学物350/590（59%）天然化学物79/139（57%）合成化学物271/451（60%）在R和/或M测试的化学物致癌强度数据库702/1348（52%）天然农药37/71（52%）霉菌毒素21/30（70%）烘咖啡中化学物理学7/34（50%）对Innes等（1969）的阴性化学物再试验17/34（50%）医师手册中报告致癌试验的药物117/241（49%）FDA申报药物数据库125/282（44%）第五十一页，共六十一页。动物外推到人具有不确定性的原因：①对外源化学物的反应敏感性，动物不能述说涉及主观感觉的毒效应。②染毒剂量高于人实际接触的剂量大得多。高剂量外推低剂量的不确定性。③小数量实验动物到大量人群外推的不确定性。④接触人群具有多样性。第五十二页，共六十一页。普拉诺尔（Practolol）眼-粘膜-皮肤综合症口服避孕药血栓性栓塞症止痛药（非那西丁等）肾损伤降糖灵乳酸性酸中毒拟交感性喷雾剂哮喘致死Clioquinol亚急性脊髓-视神经病已烯雌酚子代妇女阴道癌氯霉素再生障碍性贫血氟烷黄疸二甲麦角新碱腹膜后纤维变性反应停事件后发生的10种最严重的药物不良反应（Venning,1983）第五十三页，共六十一页。1990年以来从市场撒出的药品（最短仅上市6个月）药品冶疗分类批准撤出不良作用Grepafloxacin格雷沙星喹诺酮11/9710/99QT延长Astemizole阿司咪唑H1抗组胺12/886/99交互作用Trovafloxacin曲伐沙星喹诺酮11/976/99肝毒性Bromfenac溴芬酸消炎镇痛药12/966/98肝毒性Mibefradil咪拉地尔钙拮抗剂6/976/98交互作用Terfenadine特非那定H1抗组胺3/852/98QT延长Dexfenfluramine右苯丙胺食欲抑制药4/969/97肺性高血压，心脏瓣膜损害Felbamate苯丙氨酯抗惊厥药8/938/94骨髓发育不良Flosequi