WesternBlot常见问题及处理总结

(50(502(中班上学期期末考试卷1免疫细胞争论westernblotWesternBlot常见问题及处理总结阿木1、westernblot的优点答：灵敏，可达ngEcl显色法理论上可pg级。便利，特异性高。2:a)你的细胞中不表达这种b)你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需参与PMSF，抑制蛋白酶活性；是否有问题。3为什么呢？2答：a)SDS浓度，同时将样品煮沸时间延长，b)也不排解你的抗原浓度过高，这时再参与适量上样缓冲液即可。4、我做的蛋白质分子量很小10KDWB？答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。5、我的目的带很弱，怎么加强？答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。(50(502(中班上学期期末考试卷106、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：削减抗原上样量，降低一抗浓度，转变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。7、目标带是空白，四周有背景，是为什么？HRP催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反响时间不长，将四周底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换底物。8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？答：假设能够排解下面的几个问题那么问题多半消灭在一抗和抗原制备上。二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c)ECL底物没掩盖到相应位置；d) 二抗失活。9、我在显影液中显影15分钟后,底片漆黑一片,是什么缘由呢?答：a) 可能是红灯造成的, 胶片原来就被曝光了，可以在完全黑暗的状况下操作.看是否有改善.；b) 显影时间过长。10、DABECM好？答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 敏感的底物；ECM结果简洁把握，但被催化时灵敏度差一点，但假设到达阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。要看你试验的状况。11、抗原检测出的分子量比资料上的大，是怎么回事？答：a)抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以翻开二聚体。b)蛋白本身的修饰如：糖基化，磷酸化等12、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker转上去了，为什么？13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否确定NaF等？答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大局部时候是不用加的。14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，westernblot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？①免疫组化可以用来进展定位，但是不能准确定量，而且有时会有假阳性，不易与背分子，进展定量，但是不能定位。②两种试验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进展什么试验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。〔未加蛋白酶抑制剂点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，PMSF行吗？反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。westernblot？5×10^6就足够了17RNA又提蛋白么？这westernblot有无影响？答：能，没有问题。18、同一蛋白样品能同时进展两种因子的WesternBlot检测吗？答：固然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。19、假设目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要留意什么？答：假设是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温存得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时常常会觉察只有一局部蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶觉察有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么方法可以解决？答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用削减电流延长时间，加20％甲醇。200kd的，SDS-电泳的分别胶浓度多大适宜？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白简洁作WesternBlot吗？7％，积层胶3.5％。22、假设上样量超载，要用什么方法来增加上样量？答：可以浓缩样品，也可以依据你的目标分子量透析掉一局部小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。假设已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可1.5mm的。23、蛋白变性后可以存放多久？答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：(也是被酶水解了)。说分别胶应当承受7.5%，但资料却要求分别胶和浓缩胶均承受11％的配方，不知为何？答：上述提到的两种凝胶均可以使用，由于105KD的蛋白在上述两种胶的线性区分范围内，但需留意条带位置。25、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知承受这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？似乎有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？解答：不能使用脱脂奶粉，由于脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应当好一点．26、问一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？答：WesternBlot30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的开头摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都要拿到好的结果，假设抗体好的话比较简洁，抗体不好的话就需要反复地试了，固然有的不适合WesternBlot的怎样做也不行。27western的时候，怎样处理样品？答：必需进展研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要留意抑制蛋白酶的活性〔参与ＰＭＳＦ。28200KDwestern要留意什么呢？200kdWesternBlot时要留意，分别胶最好选择>7%的；剥胶时要留神；转移时间需要相应延长；要做分子量参照〔否则消灭杂带不知道如何分析。(50(502(中班上学期期末考试卷1429、有什么方法可以提高上样量？答：a)可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量；b)5倍的上样缓冲液来稀释变性30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求？则上样量要均多上就行了，但是不要超载.31、一抗，二抗的比例是否重要？答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉局部非特异的本底。有何要求？HRP标记的二抗。WesternBlot可以用同一种抗体吗？答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原打算簇〔又称表位而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，自然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间构造限制，煮后变性会消逝。假设你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基(50(502(中班上学期期末考试卷25酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于位，则只能用于免疫组化。34、WesternBlot 中抗体的可以重复应用吗？2－3后应在2－3泡的目的？答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？答：可以。37、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好，为什么？延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。时，同样的抗体免疫组WesternBlot却不能？WesternBlot和免疫组化。396×8转印膜，要加多少一抗？答：一抗的稀释度是有说明的，依据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般40、上下槽缓冲液有何要求，怎样才能到达最正确效果。答：无特别要求。但我们一般是上槽放颖的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液41、跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了；也可能母液〔30%聚丙酰胺〕有问题，你可以重配制一份观看；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂。42、蛋白质的分子量跨度很大，如要分别小吗？21kd，湿转120mA45-60min室的阅历调整；170kd 90-120min。43转移效率低怎么样解决？答：可以考虑：转移缓冲液中参与20%甲醇〔是指终浓度，由于甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合力气，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使NC膜〔0.2微米〕.8条带，请问什么缘由？怎样改善？胶用过marker是买的。答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或削减电泳时间试试看。固然梯度胶也是不错的选择。WesternBlot试验半定量确定要加ACTIN内参？答：对于发表文章的试验最好加内参，试验严谨。46WesternBlot内参选择什么合适？答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。GAPDH哪个好？beta-actin就可以。48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区分吗？答：一般来说提取时参与广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特别的方法，一般来说都没有区分。5%TBST脱脂奶粉”TBSTTTween吗，浓度多大？水800ml溶解,加500-1000ul的Tween-20,HClpH至7.4,加水定容至1L.50、封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比方在室温里做，或者要在4度下?答：均可在室温进展，假设时间不够，一抗4度过夜。原理是什么？答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，F不易脱落，结果较好。52、怎样才能把胶跑的格外秀丽，泳道都能很直，上样的量和