杀菌剂的毒力测定方法

第二章杀菌剂的毒力测定方法完整的杀菌剂生物测定技术：药剂毒力测定、定性定量分析、防治效果测定杀菌剂室内毒力测定与田间药效：很一致趋势一致不一致一致的情况：多菌灵对由镰刀菌引起的麦类赤霉病和恶苗病。不一致的情况：多菌灵对同样是由镰刀菌引起的棉枯黄、萎病菌。完全不一致的情况：室内毒力测定，完全不表现活性如：嘧啶胺类化合物在室内，以100ug/ml对灰霉病菌孢子没有抑制作用；300ug/ml对菌丝生长也不能抑制；1ug/ml的浓度在田间使用时，却能很好的防治灰霉病。药剂与病菌的作用关系传统的：以其“毒力”抑制或杀死病菌。一般是一致的。病菌药剂环境新类型的杀菌剂：

影响病菌的致病过程；影响寄主的抗病性；第一节杀菌剂的培养基毒力测定1孢子萌发试验法以观察供试病菌孢子是否萌发，来判定杀菌剂的毒力大小。

基本方法：将供试药剂以一定方法附着在载玻片上，然后将病菌孢子悬浮液滴在其上（或将药液与病菌孢子悬浮液混合滴于载玻片上），于保湿、定温的条件下保持一定时间，然后镜检观察孢子萌发数量。孢子萌发试验法的注意事项：1）洁净的用具；载玻片表面必须对供试菌无毒、对孢子萌发无促进作用、并能使液滴扩散一致。2）药剂附着：混合滴加、先后滴加、精密喷布3）供试菌种菌种纯、能产生大量孢子、孢子体形大，在显微镜下易观查、

4）孢了悬浮液的配制

尽可能的使供试菌产生大量孢子（培养基、培养条件、培养方法和时间）单位容积内的孢子数：50000个/ml左右，依孢子大小，一般在低倍镜下（接目镜X10，接物镜X10），每个视野20-30个孢子。有些孢子较大时还可以适当降低。5）孢子萌发的条件主要是温、湿、光、气、养分等的调节，不同病菌孢子所需要萌发条件是不一样的。6）孢子萌发标准一般以孢子萌发后的芽管大于孢子短半径时即为萌发。有些产生游动孢子的则要以孢子囊为空壳的作为萌发孢子。7）结果统计不用药的对照处理，理论上的孢子萌发率应为100%，若不为100%，要对药剂处理的孢子萌发率进行校正。

如果对照孢子萌发率在80%以上时：处理萌发率（%）校正萌发率=------------------------X100%

对照萌发率（%）如果对照的萌发率较高可采用简单校正法：

即在各处理组的调查孢子总数中增加调查孢子数量，增加的数量根据对照组孢子萌发率换算出来。如：CK孢子萌发率达98%时，在调查处理组时，拟定调查数量为100时，此时就要调查102个，并对其不萌发孢子数减去2，然后计算孢子萌发率。如果对照的孢子萌发率低于80%，应视为试验失败，需重做。8）药剂抑制病菌孢子的毒力表示：

ED50

但对同一材料不同操作人员或同一操作人员不同时间所作的结果，可能会出现差异。标准波尔多液的ED50波尔多液系数=-----------------------------供试药剂的ED502生长速率测定法

原理：将不同浓度的药液与溶化的培养基混合，制成带毒培养基平面，在平面上接种病原菌，以病原菌生长速度快慢判定药剂毒力大小。生长速率测定法注意事项：1）带毒培养基的制作应先加药液再加培养基（1：9）；对一些受热易分解的药剂则要待培养基冷却到50度左右时再加入。2）接种病原菌如果是菌丝接种，打孔制作菌饼时取材要从种菌皿的外缘开始，避免使用中心区的菌丝。如果是孢子液接种，用接种针蘸取孢子液后，在带药培养基上划一直线。3）结果检查菌饼接种的结果检查：测菌落直径，对每个菌落采取十字交叉法测两个直径，以其均数代表菌落大小。

CK菌落直径-处理菌落直径抑制生长率=----------------------------X100%

CK菌落直径

处理菌落直径-菌饼直径抑制生长率=（1-------------------------------）X100%CK菌落直径-菌饼直径3附着法原理：使真菌孢子附着在灭过菌的试验对象上（如种子、果皮、绢丝、滤纸等），再用相应方法使它们接触药剂，并给予适宜的发病条件，一定时间后，观察有无菌丝生长。

如：滤纸片附着法将真菌孢子悬浮液用一定方法附着于滤纸上，使其接触不同浓度的药剂，放在一条件下培养一定时间后，观察菌丝生长情况。

滤纸打孔干热灭菌（130℃1h）酒精消毒（70-80%20-30min）

接孢子液带菌滤纸片入药液浸渍（10min）置于培养基（2-3d）

观察有无菌丝产生

4稀释法在液体或固体培养基中加入含有一系列浓度的供试药剂，并接种供试菌进行培养，一定时间后，把具有使病菌发育完全停止的最低浓度称之为抗菌力的指标。（此法可用于抗菌素的定量测定，也即效价测定）。药剂抗菌力也即药剂毒力。5气体效力测定原理：有些杀菌剂具有挥发性，且有杀菌特性，在测定这类杀菌剂毒力时，可将麦芽汁-琼脂培养基置于皿底内，冷凝后接种病原菌孢子，然后盖上皿盖并倒过来使底成“盖”，使盖成“底”，并将杀剂菌剂置于“底”内，放到适于病菌孢子发芽生长的环境中培养一定时间后观察。6扩散法原理：在已接种的培养基上加少量的抗菌物质，使其接触培养基和病原菌，经一定时间培养后，接触部分的周围由于抗菌物质的扩散，而产生抑菌圈（或抑菌带），其大小与药剂浓度有关系，以此来比较杀菌剂的毒力大小。此法主要用于抗生素的效价测定。农用抗生素的效价效价是衡量抗生素有效成份和质量好坏的一个指标。对于一般纯净而稳定的物质，可以用重量或体积来表示它的含量，但抗生素的成品中有效成份的含量不可能达到100%，而且在加工、贮存过程中有效成份还会遭到破坏，为了保证杀菌效果，必须规定抗菌素效能的标准。

抗菌素效价的单位最初是用牛津单位。在规定标准情况下，能在50ml肉汁培养基内完全抑制金黄色葡萄球菌（牛津标准菌种）生长时青霉素的最低含量为1个牛津单位。也叫稀释单位。后来随着提练技术的提高，能获得纯净的青霉素以后，衡量抗菌素的标准也由稀释单位变为重量单位。世界卫生组织（WHO）规定：以纯净的苄青霉素钠盐的含量作为衡量抗菌素效能的标准，按重量1ug为1个单位。由于过去在青霉素研究工作中，都是采用的稀释单位，为避免重新换算的麻烦，就决定1个牛津单位相当于0.6ug苄青霉素钠盐所具有的抗菌效能作为1个国际单位。所以1mg苄青霉素钠盐就相当于1667个国际单位。目前，抗菌素效价的衡量单位可分为两类：1）稀释单位：将1mg抗菌素配成系列稀释液，对某一细菌能抑制其生长的最高稀释度，即为1mg抗菌素所含的单位。如：1mg抗生素经稀释成一系列浓度后测试，抑制病菌的最高稀释度为3600倍，那么，这个抗菌素的效价就是3600个国际单位。2）重量单位将纯净的抗菌素直接作为抗菌素效能的衡量单位。即按WHO规定1ug相当于1个单位。如：纯净的链霉素1mg就可以直接标注成1000个单位。第二节杀菌剂的寄主毒力测定以寄主植物发病程度来衡量药剂毒力的测定方法称杀菌剂的寄主毒力测定包括盆栽、温室小区和大田小区试验。1喷布用杀菌剂效力测定1.1鲜叶孢子萌发试验

摘取植物叶片，先喷布上药剂，然后再喷上病菌孢子悬浮液（或用毛细管以叶脉为中心一点点的滴下），将处理好的叶片置于保湿的培养皿内并在适宜的条件下培养一定时间，然后将叶片上的孢子染色风干，用涂有甘油透明胶的盖玻片盖到叶片上用以取下叶片上的孢子，镜检。1.2叶片接种试验在附着有药剂的作物叶片上接种病原菌，一定时间后观察发病情况，以判断药剂效果。1.3幼苗接种试验（盆栽试验）对幼苗经接种、喷布药剂后，一般应将幼苗置于接种箱或适当的保湿器中一定时间，然后才能取出放到有阳光处或温室内观察。2种子用杀菌剂的效力测定种子及病菌：从上一年重发病田中采集带病种子。土壤：用田间土壤装钵处理：拌种、浸种凉干后播种效果观察：出苗后对全部播下的种子都要进行调查，包括出苗未出苗的。3土壤杀菌剂的效力测定土壤杀菌剂是一类在缓冲作用很大的土壤中表现杀菌效力的杀菌剂。这个测定必须结合土壤进行。3.1直接法

将风干的土用8目筛过筛，装入灭菌的玻璃管内，装土厚2.5cm，放入供试菌菌丝或菌核，再装入土2.5cm，然后注入5ml供试药剂室温下培养24h后，取出供试菌菌丝或菌核放在培养基上培养，看能否正常生长。3.2盆栽