CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1在结直肠癌中的表达及意义

CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1在结直肠癌中的表达及意义

王月娇史学森白雪峰[Summary]目的探討结直肠癌中CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1的表达情况，并分析其相关性及临床病理学意义。方法收集2019年1—12月包头市肿瘤医院手术切除的结直肠癌肿物及癌旁5cm、10cm石蜡组织标本各41例，免疫组化法检测CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1的表达水平，Sanger测序法检测微卫星不稳定性。结果结直肠癌癌组织CD4+T细胞表达阳性的细胞数为108.8个，高于癌旁5cm的73.8个及癌旁10cm的38.0个，差异有统计学意义（P0.05）。结论CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1在癌组织高表达，CD8+T与CD4+T细胞两者的高表达可作为预后良好的辅助判断指标，PD-L1与CD8+T细胞表达呈正相关。[Key]结直肠癌;CD4+T细胞;CD8+T细胞;PD-L1;微卫星不稳定性[]R735.35

[]B

[]1673-9701（2021）09-0152-04TheexpressionandsignificanceofCD4+T，CD8+TcellandPD-L1incolorectalcancerWANGYuejiao1

SHIXuesen2

BAIXuefeng31.GraduateSchoolofBaotouMedicalCollege，Baotou

014040，China;2.BaotouCenterforDiseaseControlandPreventioninInnerMongollaAutonomousRegion，Baotou

014030，China;3.DepartmentofPathology，BaotouCancerHospitalinInnerMongollaAutonomousRegion，Baotou

014030，China[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheexpressionofCD4+Tcells，CD8+TcellsandPD-L1incolorectalcancer，andtoanalyzetheircorrelationandclinicopathologicalsignificance.Methods41casesofcolorectalcancertumorsandparaffintissuespecimens5cmand10cmadjacenttothecancerwerecollectedfromBaotouCancerHospitalfromJanuarytoDecember2019.TheexpressionlevelsofCD4+T，CD8+TcellsandPD-L1weredetectedbyimmunohistochemistry，andthemicrosatelliteinstabilitywasdetectedbysangersequencingmethod.ResultsThenumberofCD4+Tcellsincolorectalcancertissueswas108.8，whichwashigherthan73.8cellsin5cmadjacenttocancerand38.0cellsin10cmadjacenttocancer，andthedifferencewasstatisticallysignificant（P0.05）.ConclusionCD4+Tcells，CD8+Tcells，andPD-L1arehighlyexpressedincancertissues.ThehighexpressionofCD8+TcellsandCD4+Tcellscanbeusedasauxiliaryindicatorsforagoodprognosis.TheexpressionofPD-L1ispositivelyrelatedtoCD8+Tcells.[Keywords]Colorectalcancer;CD4+Tcells;CD8+Tcells;PD-L1;Microsatelliteinstability结直肠癌（Colorectalcancer，CRC）是一种常见的胃肠道恶性肿瘤，其发病率在所有恶性肿瘤中位居第三位[1]。近年来CRC的死亡率明显上升，因此深入研究并寻找新的治疗策略意义重大。肿瘤浸润淋巴细胞（Tumorinfiltratinglymphocytes，TIL）是肿瘤细胞免疫的重要组分，CD8+T细胞是主要的抗肿瘤效应细胞，CD4+T细胞则促进其活化增殖，二者协同可对抗肿瘤。程序性死亡因子-1（Programmmeddeath-1，PD-1）/程序性死亡因子配体-1（Programmmeddeathligand-1，PD-L1）属负性刺激分子，可诱导T细胞衰竭，促进肿瘤进展[2]。目前PD-L1的抗体阻断治疗已在微卫星不稳定（Microsatelliteinstability，MSI）型CRC中取得较为可观的疗效。但前期研究中PD-L1与CD4+T细胞、CD8+T细胞的关系分析却少有报道。本研究旨在检测CRC癌组织和癌旁组织中CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1的表达水平，并分析其相关性及意义，为CRC的预后判断及免疫治疗提供理论依据，现报道如下。1资料与方法1.1一般资料收集2019年1—12月包头市肿瘤医院手术切除的CRC肿物及癌旁5cm、10cm石蜡组织标本各41例，均为首次切除，且无结直肠免疫相关病史，术前亦未行放化疗或生物免疫治疗。其中男34例，女7例，年龄46～79岁，平均（62.63±8.47）岁;结肠癌21例，直肠癌20例;脉管癌栓阳性19例，阴性22例;神經侵犯阳性17例，阴性24例;淋巴结转移阳性19例，阴性22例;MSI阳性7例，阴性34例。年龄、性别、肿瘤部位、脉管癌栓、神经侵犯、淋巴结转移资料从原病历中获取。本研究已通过包头市肿瘤医院医学伦理委员会批准，并签署知情同意书。1.2试剂CD4兔单克隆抗体（克隆号SP35）、CD8兔单克隆抗体（克隆号SP16）、PD-L1兔单克隆抗体（克隆号MXR003）、免疫组化S-P法检测试剂盒、DAB试剂盒均购自福建迈新生物工程有限公司;石蜡包埋组织DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;MSI基因检测试剂盒购自北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司。1.3方法1.3.1免疫组化法检测CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1以切片的方式处理石蜡包埋组织，获得4.0μm厚度的薄片，在载玻片上粘附后，置于65℃环境下持续2h烘烤，再进行脱蜡，0.01MEDTA（pH=9.0）高压修复2.5min，自然冷却后，滴加0.3%的H2O210min，一抗37℃孵育1h，二抗室温孵育20min，DAB显色，苏木精复染，再经分色、返蓝、脱水、透明后封片，读片观察结果。1.3.2Sanger法检测MSI

将石蜡包埋组织切片置于1.5mL无菌离心管中，提取基因组DNA，并检测浓度，然后稀释后进行Sanger法测序，分析结果。1.4结果判读1.4.1免疫组化结果判定标准

采用病理切片扫描仪扫描切片，NDP.View2软件观察，于低倍视野下选取5个阳性细胞数最多的区域，然后将视野放大30倍，计阳性细胞数，取平均值。当细胞膜被染成棕色时，CD4+T细胞、CD8+T细胞为阳性，细胞膜与细胞质或是两者之一呈现棕黄色时，PD-L1为阳性[3-4]。1.4.2判定MSI的标准

微卫星不稳定现象发生在两个或多个微卫星DNA标记位点上，称为MSI（+），只发生在一个或更少的位点上称为MSI（-）。1.5统计学方法采用SPSS23.0统计学软件分析数据，其中PD-L1在癌旁5cm和10cm处的表达数据不呈正态分布，CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1的表达数据均显示方差不齐，因此三者表达及比较均选择非参数Kruskal-Wallis法，通过Bonferroni对组间两两比较进行校正，采用[M（Q1，Q3）]进行描述。相关性分析采用Pearson相关分析法。癌组织中三种标志物表达量与病理参数关系的分析采用二元Logistic回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1在CRC癌组织、癌旁5cm和10cm的表达水平比较CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1在CRC癌组织和癌旁组织中均有表达。CD4+T细胞在癌组织中的表达水平高于癌旁组织，在癌旁5cm的表达水平高于癌旁10cm，差异有统计学意义（P<0.05）。CD8+T细胞和PD-L1在癌组织中的表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义（P0.05）。2.2CRC癌组织CD4+、CD8+T细胞和PD-L1的表达与脉管癌栓、神经侵犯、淋巴结转移及MSI的二元Logistic回归分析CD4+T细胞在CRC癌组织中的表达与脉管癌栓和神经侵犯相关（P0.05）。CD8+T细胞的表达与脉管癌栓、淋巴结转移和MSI相关（P0.05）。PD-L1的表达与脉管癌栓、神经侵犯、淋巴结转移和MSI均无关（P>0.05）。2.3CRC癌组织内CD8+T细胞与CD4+T细胞两者和PD-L1表达间的相关性分析通过Pearson分析发现，CRC癌组织内PD-L1与CD8+T细胞的表达呈低度正相关（r=0.350，P=0.025），与CD4+T细胞无相关性（r=0.138，P=0.390）。3讨论TIL在肿瘤的发生及恶性进展中发挥了重要作用。在肿瘤发生初期，免疫系统可检测并清除已发生的肿瘤细胞，此为免疫清除阶段。该阶段既可使肿瘤细胞完全被清除，也可仅清除部分肿瘤细胞。在部分清除情况下，幸存的肿瘤细胞变体与宿主免疫系统将进入一种动态平衡。在平衡阶段，免疫系统对肿瘤细胞施加一种强有力的选择性压力，足以抑制但不能完全杀灭许多遗传不稳定且快速变异的癌细胞。在此选择期间，原肿瘤细胞的很多逃逸变种被破坏，出现新的变种，携带不同的突变基因，使它们的抗免疫攻击能力增强。总之，免疫系统未能完全清除肿瘤，却筛选出能抵抗免疫应答的肿瘤细胞，导致逃逸阶段的出现[5]。在癌症等慢性炎症部位T细胞长期激活会发生衰竭，衰竭的T细胞高水平表达受体PD-1。PD-L1与PD-1两者结合会在T细胞受体周围引起一系列的负性调节作用，有效防止T细胞活化，损害了T细胞的免疫功能，致使肿瘤发生免疫逃逸[6]。本研究结果显示，CRC癌组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞和PD-L1的表达均显著高于癌旁5cm及癌旁10cm。周玮等[7]研究发现，在50例散发性结直肠癌中CD4+T细胞、CD8+T细胞的表达率均较相应的癌旁组织高，Hua等[8]发现，PD-L1在正常大肠组织内无表达或低表达，在CRC癌组织中显著高表达，这与本研究结果类似。由此可见宿主确实对结直肠癌产生了免疫应答反应，使癌组织中的免疫效应细胞聚集增加。但结直肠癌的进展没有因为大量的淋巴细胞浸润而终止，其原因可能是肿瘤组织内高表达的PD-L1激活了PD-1/PD-L1通路，降低了T淋巴细胞活性，使癌细胞未能被完全清除而发生了逃逸。目前针对各种T淋巴细胞亞型的研究发现，高度浸润的TIL可作为判断患者预后的重要指标。Taichi等[9]和Kuwahara等[10]的研究均证实CD4+T淋巴细胞的高表达与患者的良好预后相关，还有大量的研究证据显示，CD8+TIL的密度与不同类型癌症患者的长期生存均相关[11-12]，但目前国内外关于PD-L1在CRC中的表达与临床病理参数及预后的相关性报道尚无明确共识。本研究采用Logistic回归分析的方法得出，CRC癌组织中CD4+T细胞的浸润程度越高发生脉管癌栓和神经侵犯的风险越低;CD8+T细胞的表达量越多，发生脉管癌栓、淋巴结转移及微卫星不稳定性的概率也越低。脉管癌栓、神经侵犯、淋巴结转移阴性均是预后良好的表现，且已有学者认为MSI状态下的CRC预后相对较好[13-14]，因此本研究结果与上述研究结果一致。T淋巴细胞不仅可用来评估预后，还可利用其自身的免疫活性用于肿瘤的免疫治疗。以T细胞为基础的细胞免疫疗法，在恶性黑色素瘤、乳腺肿瘤及血液系统恶性肿瘤的治疗方面已取得了一定进展[15]。但是由于肿瘤微环境中的T细胞经常被抑制，导致肿瘤组织浸润T细胞数量少、活性低，严重影响治疗效果。抗PD-1/PD-L1单克隆抗体可有效抑制PD-1/PD-L1信号传导通路，其在多种实体肿瘤中的治疗效果已得到证实[16-18]。诸多研究证明，阻断PD-1或PD-L1等免疫检查位点能增加肿瘤部位的T细胞数量，提高T细胞的免疫杀伤功能[19]。因此T细胞免疫治疗与免疫检查位点阻断二者相结合，将有望提升肿瘤治疗效果，成为肿瘤治疗研究的新观点。本研究结果显示，CRC癌组织中PD-L1与CD8+T细胞的表达存在低度正相关，进一步证实了Sudoyo等[20]的观点，认为PD-L1在CRC中的表达主要是由于CD8+T淋巴细胞的浸润所致。这将为肿瘤免疫治疗策略提供重要的理论依据。综上所述，TIL亚群CD4+T、CD8+T细胞和PD-L1在CRC癌组织中高度浸润。TIL有助于机体对抗肿瘤和提高预后，而PD-L1有可能影响TIL对肿瘤的杀伤作用，促使肿瘤发生免疫逃逸。因此，TIL细胞免疫治疗与PD-L1阻断剂结合有望开创肿瘤免疫治疗的新局面。PD-L1与CD8+T细胞的正相关性，也将为其提供理论支持。[Reference][1]王锡山.中美结直肠癌流行病学特征对比及防控策略分析[J].中华结直肠疾病电子杂志，2019，8（1）：1-5.[2]KamimuraN，WolfAM，IwaiY.DevelopmentofcancerimmunotherapytargetingthePD-1pathway[J].JNipponMedSch，2019，86（1）：10-14.[3]李蕾，陈平，潘燕柴，等.PD-Ll与肿瘤浸润性淋巴细胞在浸润性导管乳腺癌中表达的相关性[J].广东医学，2019，40（5）：702-705.[4]熊振芳，熊秋迎，万红萍，等.结直肠癌程序性死亡分子配体-1表达的临床病理意义[J].广东医学，2018，39（24）：3652-3656.[5]MittalD，GubinMM，SchreiberRD，etal.Newinsightsintocancerimmunoeditinganditsthreecomponentphases-Elimination，equilibriumandescape[J].CurrOpinImmunol，2014，27（1）：16-25.[6]TaurielloDVF，Palomo-PonceS，StorkdD，eta1.TGFβdrivesimmuneevasioningeneticallyreconstitutedcoloncancermetastasis[J].Nature，2018，554（7693）：538-543.[7]周玮，芦珊，杨刚.CD4、CD8、MSI表达与散发性结直肠癌预后关系的研究[J].实用癌症杂志，2010，25（6）：575-578.[8]HuaD，SunJ，MaoY，etal.B7-H1expressionisassociatedwithexpansionofregulatoryTcellsincolorectalcarcinoma[J].WorldJournalofGastroenterol，2012，18（9）：971-978.[9]TaichiK，ShoichiH，NobuakiS，etal.Intratumoural-infiltratingCD4+andFOXP3+Tcellsasstrongpositivepredictivemarkersfortheprognosisofresectablecolorectalcancer[J].BrJCancer，2019，121（8）：659-665.[10]KuwaharaT，HazamaS，SuzukiN，etal.Correction：Intratumoural-infiltratingCD4+andFOXP3+Tcellsasstrongpositivepredictivemarkersfortheprognosisofresectablecolorectalcancer[J].BrJcancer，2019，121（11）：983-984.[11]YaoW，HeJC，YangY，etal.Theprognosticvalueoftumor-infiltratinglymphocytesinhepatocellularcarcinoma：asystematicreviewandmeta-analysis[J].SciRep，2017，7（1）：7525.[12]EriksenAC，S？覬rensenFB，LindebjergJ，etal.Theprognosticvalueoftumor-infiltratinglymphocytesinstageⅡcoloncancer：ANationwidepopulation-basedstudy[J].TranslOncol，2018，11（4）：979-987.[13]GhanipourL，Jirstr？觟mK，Sundstr？觟mM，etal.Associationsofdefectmismatchrepairgeneswithprognosisandheredityinsporadiccolorectalcancer[J].EurJSurgOncol，2017，43（2）：311-321.[14]蔣娜，隋燕霞，蒋依娜，等.散发性结直肠癌微卫星不稳定状态与临床病理特征及预后的关系[J].安徽医科大学学报，2019，54（1）：139-142.[15]王蓓蕾，李昌盛，杨一娴，等.CAR-T细胞免疫疗法的现状及展望[J].国际免疫学杂志，2020，43，（