亚硝酸盐还原酶高产菌株的筛选与鉴定

亚硝酸盐还原酶高产菌株的筛选与鉴定

亚硝酸盐（nit）的外观与用盐非常相似，颜色为白色或黄色，通常存在于自然界和日常生活中。在自然环境下，NIT由硝酸盐还原生成和铵盐氧化生成，硝酸盐和铵盐本身都是无毒的，在特定条件下经化学反应后就会生成有毒的NIT,NIT被用作添加剂是法定许可的，而且常作为添加剂广泛用于食品加工中。当然，NIT的使用量须严格管控，GB2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中明确规定其使用量不得超过150mg/kg，残留量不得超过30mg/kg亚硝酸盐还原酶（nitritereductase,NIR）能够还原亚硝酸盐，生成NH植物乳杆菌等产生的NIR在25℃～38℃时酶活均较高，其最适温度为30℃左右，当温度为15℃时，NIR的酶活会受到抑制，酶活力降至原来的10%；当温度为50℃时，酶会失去活性。NIR在pH值为5～6时，酶均表现有较明显活力，酶的最适反应pH值为5.5。与酸性环境不一样，在碱性环境中，酶活性将受到限制甚至全部消失。在这些最适反应条件下，测得酶的米氏常数Km值为120.5μg/mL目前研究表明，只有部分乳酸菌会产生NIR，且会因基因表达差异而产生不同类型的亚硝酸盐还原酶。本文对自然发酵泡菜中产生的亚硝酸盐微生物进行分离纯化，对其中降解NIT效率最高的菌株鼠李糖乳杆菌N-6的培养基和部分培养条件进行优化，对酶液进行初步纯化，并测定纯化后的酶活性。1材料和方法1.1试剂与仪器：培养基、引物自然发酵泡菜：市售；MRS液体培养基：蛋白胨2g、葡萄糖4g、乙酸钠1g、硫酸镁0.04g、硫酸锰0.01g、牛肉粉1g、酵母粉0.8g、磷酸氢二钾0.4g、柠檬酸三铵0.4g、吐温800.2mL、蒸馏水200mL；平板筛选培养基：MRS液体培养基加入2.8g琼脂，200mL去离子水；盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸、亚硝酸钠：国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨、葡萄糖、乙酸钠、盐酸萘乙二胺、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、对氨基苯磺酸、硼酸钠、乙酸锌、亚氰化钾、盐酸、冰乙酸（分析纯）：北京北化精细化学品有限责任公司；引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；以上试剂均为分析纯。1.2热浴锅、反渗透和冷冻高速离心BS2202S型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；BXM-30R高压灭菌锅：上海博讯实业有限公司；HH-SY11-Ni1电热恒温水浴锅：北京长安科学仪器厂；UVmini-1240紫外可见分光光度计：日本岛津公司；4k153-18k冷冻高速离心机：Sigma公司；DYY-12C电泳仪：北京六一仪器厂。1.3亚硝酸钠含量测定1.3.1色瓶中对氨基苯磺酸溶液盐酸萘乙二胺溶液：准确称取0.1g盐酸萘乙二胺，溶解于50mL超纯水中，混匀，置棕色瓶中，避光4℃保存待用；对氨基苯磺酸溶液：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL20%盐酸中，置于棕色瓶中混匀，避光保存待用。亚硝酸钠标准溶液：准确称取0.1g亚硝酸钠，加入超纯水溶解，移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液即为亚硝酸钠标准溶液。1.3.2盐酸反应物的制备准确吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、5.0mL亚硝酸钠标准溶液，分别置于50mL容量瓶中，加入40mL超纯水，摇匀，加入2mL对氨基苯磺酸溶液，摇匀，置于避光处反应5min；再加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，定容至50mL，混匀，避光静置15min。设置分光光度计波长为538nm，分别测定吸光值，以亚硝酸钠溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制亚硝酸钠标准曲线。亚硝酸钠在0～0.25μg/mL的浓度范围内与A1.4高产nir菌筛选1.4.1双歧杆菌酸奶培养活化培养基为MRS液体培养基，配制100mLMRS培养基，接种1g双歧杆菌酸奶发酵剂，置于摇床中30℃，180r/min，培养24h。1.4.2培养基培养方法配制300mLMRS琼脂培养基将活化好的新鲜种子液分别稀释1、10、100、1000倍，将这4种浓度的菌液以涂布法接种在平板中，每个浓度接种2个平板，30℃培养24h。配制500mLMRS液体培养基，121℃灭菌20min，选取长势较好菌落，用接种环分别接种到锥形瓶中，30℃培养24h。从平板中筛选的菌落序号分别为N-1、N-2、N-3、N-4、N-5、N-6、N-10、N-14、N-17、N-21、N-22、N-25、N-28、N-29、N-311.4.3用乙二胺钠分光光度法测定了植物分解亚硝酸盐的能力1.4.3.亚铁氰化钾溶液饱和硼酸钠溶液：称取50g硼酸钠，溶于1000mL热水中，冷却备用；乙酸锌溶液：称取22g乙酸锌，加入3mL冰乙酸，最后再加水稀释到100mL；亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾，加水至100mL，搅拌溶解；盐酸萘乙二胺溶液：称取0.1g盐酸萘乙二胺，溶解于50mL水中，搅拌混匀，放入棕色瓶中备用；对氨基苯磺酸溶液：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶解于100mL去离子水中，放进棕色瓶中备用。配制NaNO1.4.3.总糖含量的提取试样处理：吸取5mL样品，分别置于250mL三角瓶中，加入饱和硼砂溶液12.5mL，摇匀后再加入约50mL蒸馏水，沸水锅里加热15min，取出后冷却至25℃，再转移到100mL容量瓶中，加入5mL亚铁氰化钾溶液，混匀，再加入5mL乙酸锌溶液，定容到100mL，充分混匀，静置约30min，沉淀样品中的蛋白质。这沉淀进行抽滤，弃去初滤液30mL，收集剩余的滤液。吸取2mL上述滤液于50mL容量瓶中，加水40mL，摇晃均匀，先加入2mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，避光静置5min，再加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，定容至50mL，混匀，避光静置15min，在波长538nm处测定吸光值1.5rt-pcr反应条件引物序列为27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;1492r:GGCTACCTTGTTACGACTT。PCR的反应条件：95℃预变性5min,95℃变形30s,58℃退火30s,72℃延伸1.5min，共循环30次，最后72℃延伸10min。基因测序：由北京华大测序公司进行。1.6碳源种类对养殖的影响筛选出的高产菌株，以NIT为指标，以碳源、氮源、磷源、培养温度与培养方式作为影响因素进行单因素试验，初始培养条件设定为2%葡萄糖、0.5%酪蛋白胨、0.2%磷酸二氢钾、培养温度37℃，动态培养，其中碳源分别选取蔗糖、葡萄糖和乳糖，并以不加碳源为空白对照。氮源分别选取蛋白胨、酪蛋白胨及胰蛋白胨，以不加氮源为空白对照，磷源分别选取磷酸二氢钠、磷酸氢二钠及磷酸二氢钾，以不加磷源为无磷空白对照，培养温度分别选取20、30、37、40℃，培养方式选用动态和静态两种不同培养方式1.7亚硝酸盐还原酶的提取和分离1.7.1测定蛋白质浓度双缩脲法测定蛋白含量，首先制定标准曲线，测得蛋白质含量的回归方程曲线y=0.0773x+0.005，回归系数R1.7.2酶活性测定1.7.2.1.酶活性计算酶活力单位定义：每小时降解1μg亚硝酸盐所需要的酶量为一个酶活力单位（U），即1U=1μg/h。1.7.2.2-酶活性反应系统取干净试管，加入1%葡萄糖1mL,50μg/mLNaNO1.7.3制备与提取的粗酶溶液亚硝酸还原酶粗酶液的提取制备方法为溶菌酶和超声波破碎，具体制备过程参照文献1.7.3.超声波破碎法将初筛获得的菌株分别接入含0.2mg/mL亚硝酸钠的培养基中，30℃培养24h。分别取菌液100mL,6000r/min4℃离心10min。收集沉淀，弃去上清液，用10mL磷酸盐缓冲液（pH=7.2）。振荡，将菌体悬浮，加入溶菌酶，使其浓度为5mg/mL,30℃反应24h。经过超声波破碎后，8000r/min4℃离心15min。取上清液即为粗酶液1.7.3.硫酸铵分级沉淀本研究采用硫酸铵沉淀法来沉淀上清液中的蛋白成分。根据盐析粗酶液的体积，称取30%硫酸铵，置于4℃冰箱4h，再离心（20min、6000r/min），留上清液去沉淀。向上清液中继续添加硫酸铵（饱和度达到60%),4℃放置4h，离心（15min,1200r/min），收集沉淀。将沉淀溶于粗酶液同体积的磷酸盐缓冲液（0.2mol/L、pH7.2)1.7.3.3分析选用的透析袋截留范围是8000～14000，透析袋的预处理参考文献1.7.3.蛋白质的提取选择的阴离子交换层析为DEAE琼脂糖凝胶CL-6B，层析柱规格为1.6cm×30cm。具体操作步骤如下：根据柱子大小取适量的凝胶。凝胶高度达到柱子高度的80%左右，自然沉降。沉降完成后用去离子水平衡12h，备用，取粗酶液，上样量3mL。上样前过0.22mm孔径聚醚砜滤膜，除去不溶物。洗脱：用含0.5mol/LNaCl的0.002mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐在2mL/min的流速下进行洗脱，洗脱液每5min收集一管，每管3mL，共收集80管；检测：经酶标仪在280nm波长下测定每一管蛋白溶液的吸光值，并绘制层析图谱。然后收集峰值较高处的蛋白，用双缩脲法检测蛋白质含量；再生：用洗脱液洗脱各组分直到完全洗脱，即可加入新的样品，继续使用。1.8处理数据利用Excel进行数据汇总，并利用Origin95进行绘图。2结果与分析2.1菌落初步筛选不同菌落作用后的亚硝酸钠含量见图1。通过盐酸萘乙二胺分光光度法测试菌株分解亚硝酸盐能力，由图1可知，亚硝酸钠含量越高，意味着降解率越底，因此初步筛选出亚硝酸钠含量较低的菌落，分别为N-6、N-25、N-28、N-31。2.2乳酸杆菌对nit的降解率不同菌落的NIT降解率结果见图2。如图2所示，从泡菜样品中，初步筛选得出N-6、N-25、N-28、N-31号乳酸杆菌可高效降解NIT，其中N-6的降解率最高。经16SrDNA序列测序鉴定为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）。2.3鼠李糖乳杆菌nir的最佳条件探索试验得出了鼠李糖乳杆菌N-6为最高产亚硝酸盐还原酶的乳杆菌，因此将进一步研究探索出影响鼠李糖乳杆菌产生NIR的最佳条件。影响乳杆菌降解NIT因素有很多，包括碳源、氮源、磷源、培养方式及培养温度等，本文对上述影响因素进行试验，得到鼠李糖乳杆菌产生NIR的最佳条件。2.3.1最佳碳源对鼠李糖乳杆菌t不同碳源对鼠李糖乳杆菌降解亚硝酸盐结果见图3。由图3可知，无碳对照的NIT降解率为0.01%，由此说明碳源对鼠李糖乳杆菌影响较大，其中葡萄糖为最佳碳源，其降解率为52.22%，其降解亚硝酸钠的能力明显更强。这可能是由于鼠李糖乳杆菌自身对糖的转运和代谢效率会因糖而异，导致在降解亚硝酸盐上的差别。2.3.2大鼠李糖乳杆菌nit的降解不同氮源对降解NIT的影响见图4。由图4可知，无氮对照的NIT降解率为44.44%，其中氮源为酪蛋白胨时鼠李糖乳杆菌的降解率最高，为68.89%。因此，此菌的最佳氮源为酪蛋白胨。2.3.3鼠李糖乳杆菌最佳磷源的确定不同磷源对鼠李糖乳杆菌降解亚硝酸盐结果见图5。由图5可知，无磷对照的降解率高于磷酸二氢钠与磷酸氢二钠，而低于磷酸二氢钾，因此鼠李糖乳杆菌的最佳磷源为磷酸二氢钾。2.3.4温度对大鼠李糖菌的分解亚硝酸盐的影响不同培养温度对鼠李糖乳杆菌降解亚硝酸盐结果见图6。由图6可知，鼠李糖乳杆菌的最适培养温度为37℃。2.3.5鼠李糖乳杆菌对亚硝酸盐的降解率采用静置培养和动态培养（摇床通气培养）两种培养方式，结果见图7。由图7可知，动态培养鼠李糖乳杆菌时，其亚硝酸盐降解率较高，而静态培养对亚硝酸盐降解率相对较低，在动态培养中培养基的营养成分能被充分利用，菌株活力变强，而静态培养的菌株则相对不能充分利用营养。2.4亚硝酸盐还原酶的分离和精制2.4.1离心处理对蛋白酶活性的影响盐析过程酶活性见表1。由表1可知，经30%硫酸铵盐析处理，离心后所得蛋白沉淀测得酶活：303.875U/mL；经60%硫酸铵处理上清液，离心后所得蛋白沉淀测得酶活力：309.375U/mL，上清液中无酶活性。上清液已经无法检测出酶活性，表明酶蛋白已经完全经盐析沉淀下来，得到很好的分离。同时也表明，60%的硫酸铵浓度更有利于蛋白质的析出。因此，对于此还原酶来说，盐析时选择较高浓度的盐浓度（60%）比较有利于蛋白质沉淀完全。2.4.2酶活力检测结果DEAE琼脂糖凝胶CL-6B层析图谱见图8。如图8所示，DEAE琼脂糖凝胶CL-6B层析图谱包含4个洗脱峰值，收集这4个峰值附近的几个酶活力高的洗脱液进行浓缩，测定蛋白含量和酶活力。A处的洗脱液酶活力最高为764.49U/mL，其它洗脱峰经检测后均无酶活，可能为杂蛋白。粗酶液、盐析、透析与阴离子交换柱的蛋白含量与酶活力见表2。由表2可知，经过盐析后亚硝酸盐还原酶的活性无显著提升，在采用透析袋，透析24h后，经透析后测得还原酶活力为：208.48U/mL。经透析除盐后，相对于上述盐析后的酶液酶活性有所提高。经DEAE柱层析分离纯化后还