植物生物技术-植物遗传转化载体课件

第十章

植物遗传转化载体1第十章植物遗传转化载体11•••••遗传转化常用的选择标记基因及及无选择标记基因转化第一节

植物遗传转化载体的种类及特点第二节

农杆菌质粒系统的结构、功能和构建第三节

植物病毒载体第四节

叶绿体转化载体第五节系统本章主要内容第

10章植物遗传转化载体2••遗传转化常用的选择标记基因及及无选择标记基因转化第一节2本章教学目的与要求根癌农杆菌

Ti

质粒的结构与功能名词：一元载体、双元载体、卸甲载体叶绿体转化的优势与意义遗传转化中常用的选择标记基因、报告基因3第

10章植物遗传转化载体本章教学目的与要求根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能3第13植物遗传转化的基础植物遗传转化也称为转基因技术

(transgene

technology)是指将人工分离和修饰过的外源基因导入生物体的基因组中，从而使生物体的遗传性状发生改变的技术植物遗传转化的基础植物遗传转化4植物转基因的优越性

对植物基因型和表现型的改变只作用于目标性状，

不涉及非目标累赘基因，因而更具有针对性，可加快育种进程；

可克服传统育种中不同Th物之间的Th殖隔离等限制，扩大可利用的资源库（动物、植物、微Th物、人工合成基因均可利用）；

可创造出自然界所没有的新种质；

以转基因植物为主体的植物化工厂具有高效、低污染、可再Th的优点。植物转基因的优越性对植物基因型和表现型的改变只作用于目标性5第一节

植物遗传转化载体的种类及特点一、植物遗传转化载体的特点作为植物遗传转化的载体，必须具有两种功能：1.

能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去2.

它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的

DNA

序列，以保证导入的外源基因能在受体植物细胞中正常复制和表达第一节植物遗传转化载体的种类及特点一、植物遗传转化载体的特6质粒载体Ri质粒载体共整合载体系统Ti质粒载体双元载体系统二、植物基因工程载体的种类病毒载体单链RNA病毒载体单链DNA病毒载体双链DNA病毒载体质粒载体Ri质粒载体共整合载体系统双元载体系统二、植物基因工7第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建农杆菌是一类革兰氏阴性土壤杆菌（

G

－），活在植物根的表面依靠由根组织渗透出来的营养物质（冠瘿碱）生存的一类细菌。农杆菌可分为根癌农杆菌

Agrobacterium

tumefaciems

（含

Ti

质粒）和发根农杆菌

Agrobacterium

rhizogenes （含

Ri

质粒）

，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的

Ti

质粒介导的遗传转化最多。第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建农杆菌是一类革兰氏阴8根癌农杆菌侵染植物后产生冠瘿瘤根癌农杆菌侵染植物后产生冠瘿瘤9一、根癌农杆菌

Ti

质粒的结构与功能Ti

质粒

(

tumor

induced

Plasmid)

是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状

DNA

分子，其分子量为95--156

x

106 D

，约有

150--200kb依据

Ti

质粒诱导的植物冠瘿瘤种类的不同，

Ti

质粒可以分为四种类型：

章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和农杆菌素碱型（

agrocinoPine

）或琥珀碱型（

succinamo

Pine

）一、根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能Ti质粒(tum10Ti

质粒结构T-DNA

区CytokininAuxin Opine左边界右边界Ti

质粒travir

区Con区Ori区T-DNA

区Auxin左边界CytokininOpineCon区右边界vir

区Ori区Ti

质粒tra毒性区（

vir

区）：激活

T

－

DNA

的转移T

－

DNA

区：

侵染植物时，

从

Ti

质粒上被切割，

转移到植物细胞中，带有与肿瘤形成有关的基因存在与细菌间进行接合保证

Ti

质粒进行自我接合转移区：有关的基因复制起始区：复制Ti质粒结构T-DNA区T-DNA区Auxin左边界C11（一）

T-DNA

的结构特点及功能

编

长长

左左码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。度一般为

12-24kb

，是

Ti

质粒最重要的部分。右边界分别为

25bP

的重复序列，其中14bP

是核心，是完全保守的。

右边界对于致瘤必不可少。（一）T-DNA的结构特点及功能编码冠瘿碱的合成，能随12（二）

Vir

区的结构和功能：

该区段上编码的基因能激活

T-

DNA

转移，

使农杆菌表现出毒性，故也称作致毒区。

T-

DNA

区与

Vir

区在质粒上彼此相邻，

合起来约占

Ti

质粒

DNA的三分之一

Vir

区段总长度大约

35kb

，由

6

个互补群组成，

分别命名为VirA

、

VirB

、

VirC

、

VirD

、

VirE

、和

VirG

。

Vir

区中各个基因之间都是相互联系相互影响的，缺一不可。

当

Vir

基因与

T-

DNA

分别位于两个不同的复制子上时，即

Vir

区与

T-

DNA区分割开来以后， Vir

基因仍然能够为

T-

DNA

提供转移功能（二）Vir区的结构和功能：该区段上编码的基因能激活13

毒性区中各个位点的表达情况可以分为两种组成性表达：在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水平；VirA

属于组成型表达的位点诱导性表达：即这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物受伤组织时，植物细胞分泌的信号分子（

乙酰丁香酮及羟基乙酰丁香酮）作用下才能启动表达；

VirB

、

VirC

、

VirD

和

VirE

是属于诱导性表达的位点virG

既为组成型表达，也具有诱导表达的特性，

在信号分子的诱导下，表达量提高

10

倍毒性区中各个位点的表达情况可以分为两种组成性表达：在无植物14Vir

区基因的功能：Vir

A

蛋白––

帮助植物细胞接受植物信号分子；Vir

G

蛋白––

对毒性区的其他基因进行正调节Vir

B

蛋白––

形成膜通道，

使

T-DNA

转移到细菌细胞外

Vir

D

蛋白––

VirD

1

、 VirD

2

诱导

T-DNA

形成单股

DNA

片段，

并形成

复合物（

T-

DNA-

Vir

D2

）；Vir

E

蛋白––

与单链

T-DNA

结合（

形成

T

复合物），保护

T-

DNA

不被胞

外核酸酶降解转入植物细胞，

整合到寄主基因组中；Vir

C

蛋白––

与切割单链

T-

DNA

有关Vir

F

蛋白––

协助

T-

DNA

转移到宿主植物细胞中Vir

H

蛋白对植物产Th的杀菌或抑菌物进行解读Vir区基因的功能：VirA蛋白––帮助植物细胞接受15二、发根农杆菌

Ri

质粒的结构和功能Ri

质粒：

200kb-

800kb

，

其基本结构也与

Ti

质粒相似，

包括致瘤区（

Vir

区）、

T-DNA

区和复制起点

Ori

。根据其合成的冠瘿碱种类的不同可分为三类：

农杆碱型、甘露碱型和黄瓜碱型。农杆碱型

Ri

质粒有两段

T-

DNA

，即

TL

和

TR

，

可以分别插入植物基因组；甘露碱型和黄瓜碱型

Ri

质粒只有单一

T-DNA

，

甘露碱型和黄瓜碱型

Ri质粒的单一

T

区除其

25bP

边界重复序列外，其他部分与

Ti

质粒同源性很低，但它们与农杆碱型

Ri

质粒的

TL

区有较高的同源性。二、发根农杆菌Ri质粒的结构和功能Ri质粒：200k16三、

Ti

质粒载体的改造Ti

质粒作为载体的可能性能够自发地整合到植物的染色体上。能转化多种植物。强启动子：

T-DNA

的

oPine

合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。三、Ti质粒载体的改造Ti质粒作为载体的可能性17天然

Ti

质粒载体的缺点分子量太大（

200kb

），

基因工程中难以操作

；限制性酶切位点太多，

难以找到单一的限制性位点

；T-DNA

区致瘤基因产物使被转化的植物细胞成为肿瘤，阻碍细胞的分化和植株再生；在大肠杆菌中不能复制；质粒上存在一些对

T-DNA

转移不起作用的基因天然Ti质粒载体的缺点182

、除去

T-

DNA

上的有机碱Th物合成基因（

tmt

）；

因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，

影响植物细胞的Th长；3

、除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，

最大限度地缩短载体的长度；、安装大肠杆菌复制子，

使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；、安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，

使用植物基因的启动子和Poly

A

化信号序列；、安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。Ti

质粒的改造1

、除去

T-

DNA

上的Th长素（

tms

）和分裂素（

tmr

）

Th物合成基因，

因为大量的Th长素和分裂素会抑止细胞再Th长为整株植物；2、除去T-DNA上的有机碱Th物合成基因（tmt19（一）中间载体

中间载体：

带有重组

T-DNA

的大肠杆菌质粒的衍Th载体

目的：

解决体外操作中农杆菌不能直接导入目的基因的困难

具有

bom

位点

,

中间载体可以在不同细菌细胞间进行结合转移

能在两种不同的Th物中复制的，

既能在原核Th物中复制，

又能在真核Th物中复制的载体。

具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，

还有真核Th物的自主复制序列

(

ARS)

以及选择标记性状具有多克隆位点。（一）中间载体中间载体：带有重组T-DNA的大肠杆菌20卸甲载体由于影响植株再Th的直接原因是

T-DNA

中的

Onc

基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成为无毒的质粒，

即“卸甲”

其“武装”的

Ti

载体，称为“卸甲载体”。卸甲载体：构建无毒的

Ti

质粒载体例：

PGV3850:

是从胭脂碱

Ti

质粒

PTiC58

衍Th而来的PGV2250:

是从章鱼碱

Ti

质粒

PTiB6S3

衍Th而来的卸甲载体由于影响植株再Th的直接原因是T-DNA中的O21（二）中间表达载体中间表达载体：

是由中间载体（含选择标记）加上能在植物细胞中表达的启动子及目的基因构成，也就是嵌合基因插入中间载体后构成。嵌合基因（

chimeric

gene

）外源基因和植物表达元件（启动子、终止子、

5‘

和3’UTR

内含子、信号肽等）连接在一起构成基因。（二）中间表达载体中间表达载体：是由中间载体（含选择标记）22启动子

Ti

质粒Nos

（

胭脂碱合成酶基因）、

Ocs

（章鱼碱合成酶基因）等基因具有与真核Th物启动子类似的

TATA

盒和

CAAT

盒，均能在植物细胞中表达，

并且无组织特异性。因此，

它们成为早期构建嵌合基因的启动子。

Ca

MV

的

35s

启动子花椰菜花叶病毒

DNA

的的

35s

启动子能使嵌合的外源基因在植物细胞中表达。启动子Ti质粒因具有与真核Th物启动子类似的TATA23（三

)

植物遗传转化载体系统一元载体转化系统（共整合载体）转化载体系统双元载体转化系统（三)植物遗传转化载体系统一元载体转化系统241. 一元载体（

共整合）系统：有

2

个独立的质粒，农杆菌

Ti

质粒和大肠杆菌中间载体将外源基因装载到小质粒上，

然后把载有外源基因的小质粒通过同源重组的方法导入农杆菌的

Ti

质粒。1. 一元载体（共整合）系统：有2个独立的质粒，农杆25Ti

质粒的其他部分PBR322

（含AMPr

）胭脂合成酶基因（

Nos)右边界（

RB

）左边界（

LB

）PBR322vector目的基因

重组载体卸甲载体外源基因插入

PGV3850

的过程中间载体共整合载体Ti质粒的其他部分PBR322（含AMPr）左边界（262.

双元载体系统是指由两个分别含

T-DNA

和

Vir

区的相容性突变

Ti

质粒构成的双质粒系统

,

又因为其

T-DNA

与

Vir

基因在两个独立的质粒上，

通过反式激活

T-DNA

转移

,

故称之为反式载体（

trans

vecter

）。穿梭载体（中间载体）主要包括两个载体（

Ti

质粒）卸甲载体（

Ti

质粒）目的基因目的基因T-DNA

区左边界右边界OriA植物选择标记基因细菌选择标记基因OriE中间载体vir

区细菌选择标记基因Ori

区卸甲载体2. 双元载体系统是指由两个分别含T-DNA和Vir27帮助质粒农杆菌农杆菌感染植物接合转移进入植物细胞核整合，表达VirE.coli穿梭载体左右外源基因Vir左右外源基因左右外源基因双元载体系统转化过程帮助质粒农杆菌农杆菌感染植物接合转移进入植物细胞核整合，表28Ri

质粒的

T-DNA

上的基因不影响植株的再Th，野Th的

Ri

质粒直接可以用作转化载体。Ri

转化载体也有两种构建策略

:共整合载体：与

Ti

质粒的共整合载体的不同之处是可直接利用野Th型的

Ri

质粒。双元载体：与

Ti

质粒相同，其原理主要是

Ri

质粒的

Vir基因反式作用驱动

T-DNA

转移。4.

Ri

转化载体的改造Ri质粒的T-DNA上的基因不影响植株的再Th，野Th29第三节

植物病毒载体病毒转化载体抗原展示型体载互性体补载插入型体载置型体换载双链DNA病毒转化载体单链RNA病毒转化载体单双链DNA病毒转化载体第三节植物病毒载体病毒转化载体抗原展示型体载互补插入30一、双链

DNA

病毒转化载体花椰菜花叶病毒（

CaMV

）：8kb

，

环状

ds-DNA

，

8

个

ORF

，

最多可容纳

250bP

外源

DNA

，

只能

用于短暂表达

(transient

exPression)感染范围窄；不整合到染色体中；外源基因表达水平高；表达时间较短；一、双链DNA病毒转化载体花椰菜花叶病毒（CaMV）31二、单链

RNA

病毒转化载体

TMV （烟草花叶病毒）载体优点：转化频率高

;宿主范围广

;高拷贝，外源基因高效表达。可构建抗原展示载体二、单链RNA病毒转化载体TMV （烟草花叶病毒32三、单链

DNA

病毒转化载体双生病毒：

2.5-3kb

，环状

ss-DNA

，可感染单子叶植物。整合到染色体中；无致病性；免疫原性弱；可长期表达外源基因；三、单链DNA病毒转化载体双生病毒：2.5-3kb，33四、病毒转化载体的构建、置换型载体：

外源基因置换病毒基因组的外壳蛋白等基因、插入型载体：外源基因插入到病毒本身启动子下游、基因互补载体：

外源基因插入到有功能缺陷型病毒组分或亚组分内，可采用

2

种交替突变的病毒，

可同时在宿主中存在、抗原展示型载体：在病毒外壳蛋白基因内选择性插入外源基因，将外源基因展示在病毒粒子的表面四、病毒转化载体的构建、置换型载体：外源基因置换病毒基因组34五、病毒载体与质粒载体的比较优点植物病毒或其侵染性的基因组是以一定的传播途径侵入寄主植物，

由其构建的载体能把外源基因直接导入植物细胞，复杂的装配过程由细胞完成，而

Ti

质粒载体是通过侵染转化等复杂的转移过程而完成

Ti

质粒载体转化时将外源基因整合到植物核基因组上，而病毒载体感染植物后，一般不整合到植物细胞核

DNA

上，从而防止无限传代扩散，故比较安全可靠五、病毒载体与质粒载体的比较优点Ti质粒载体转化时将外源35

病毒载体感染植物细胞以后只是利用寄主细胞的功能在细胞质进行复制和表达；同时又由于病毒具有高效自我复制能力，故在转化植物中可得到高拷贝外源基因，从而十分有利于外源基因的表达和功能的实现

病毒能系统地侵染整株植物，避免了单细胞、原Th质体或组织、器官的转化和再Th培养，

能较快地获得转基因植物

植物病毒的寄主范围较广，

因而由某种病毒基因组构建的载体可用于多种不同植物的遗传操作病毒载体感染植物细胞以后只是利用寄主细胞的功能在细胞质进行36存在的问题：1

、安全性2

、靶向性3

、有效性细胞毒性染色体毒性免疫毒性转导靶向性转录靶向性转导效率靶向性基因表达水平和持续时间表达的可调控性存在的问题：1、安全性细胞毒性染色体毒性免疫毒性转导靶37第四节 叶绿体转化载体一、叶绿体基因组的特点第四节 叶绿体转化载体一、叶绿体基因组的特点38高等植物的叶绿体基因组：①.

多数高等植物的

ctDNA

大约为

150kbP

：烟草ct

DNA

为

155

844bP

、水稻ct

DNA

为

134

525bP

。②.ctDNA

约能编码

126

个蛋白质：12%

序列是专为叶绿体的组成进行编码；③.

叶绿体的半自主性：有一套完整的复制、转录和翻译系统，但又与核基因组紧密联系。

如,

叶绿体中

RuBP

羧化酶的生物合成

8

个大亚基(

由叶绿体基因组编码

)+

8

个小亚基

(

由核基因组编码)高等植物的叶绿体基因组：①.多数高等植物的ctDNA39二、

叶绿体转化的发展二、叶绿体转化的发展40三、叶绿体转化载体的结构左侧质体同原序列启动子5‘UTR

增强区3’UTR

终止子目的基因启动子3’UTR

终止子目的基因5‘UTR

增强区右侧质体同原序列外源基因整合的靶位点：

trnV

和

3’rPsl2

间,trnG

和trnfM

间，

trn1

和trnA

间三、叶绿体转化载体的结构左侧质体同原序列启动子5‘UTR增41四、表达调控元件（一）

NEP

和

PEP

型启动子调控元件16SRNA

操纵子的启动子

Prrn光调控的

psbA

启动子（二）

5’UTR 的核糖体结合位点噬菌体

T7

基因

10

表达序列

T7g10人工合成的

18bp

包含核糖体结合位点的

rbcL5’UTR（三）

诱导型启动子（四）

3’UTR 终止子：

TrbcL,TpsbA,

Trbs16,TrrnB（五）

多基因表达元件50bp

的多顺反子间基因表达元件四、表达调控元件（一）NEP和PEP型启动子调控元件42植物生物技术-植物遗传转化载体课件43烟草叶绿体转化烟草叶绿体转化44外源基因定点整合多个基因可以同时表达原核基因无需修饰改造就能直接表达蛋白表达水平高母系遗传，环境风险小易于保持纯系、后代不分离导入的外源基因性状稳定性高叶绿体基因组转化的外源基因表达具有组织特异性四、

叶绿体转化相对于核转化的优势外源基因定点整合四、叶绿体转化相对于核转化的优势45五、叶绿体基因工程的应用生物反应器农作物遗传育种，改良农艺性状理论研究五、叶绿体基因工程的应用生物反应器461. 叶绿体生物反应器研究将植物叶绿体作为生物反应器进行生物制药、表达药用蛋白和疫苗，

具有许多独特的优势。它可以大大降低生产和运输成本、外源蛋白稳定性高、易于纯化等。这些独特的优势使叶绿体基因组成为生产食用蛋白和人类药用蛋白的理想平台。1. 叶绿体生物反应器研究472. 应用于农作物遗传育种提高作物抗性抗旱基因、抗病原体蛋白基因、抗虫基因、抗除草剂基因、耐盐基因等一些重要的与抗逆相关的基因已经实现叶绿体中的高表达提高作物的营养价值叶绿体参与了许多代谢反应

,

如氨基酸、脂肪酸、淀粉等物质的生物合成。因此

,

通过叶绿体遗传工程技术

,

改造控制这些反应的酶系统

,

或者直接将有意义的外源基因导入叶绿体

,

将有可能实现叶绿体中高表达人类必需的氨基酸、脂肪酸、蛋白质等营养物质

,

从而提高作物的营养价值。提高作物产量叶绿体能够把光能转换成对作物有用的化学能

,

而化学能是作物生物产量形成的基础能量来源。所以

,

通过改善叶绿体的光合性能

,

比如对光合作用关键酶

Rubisco

进行改造

,

能够提高光合效率

,

进而增加农作物产量。2. 应用于农作物遗传育种483. 促进基础理论研究叶绿体基因表达调控机制；核质基因的互作机制；光合作用的机理；叶绿体基因的功能鉴定和叶绿体进化等；3. 促进基础理论研究49第五节

遗传转化常用的选择标记基因及及无选择标记基因转化系统在转化过程中，仅仅只有极少数植物受体细胞能获得外源基因，而其中目的基因被整合到受体植物基因组并实现表达的细胞就更少因此，需要尽早对转化细胞进行选择，常用的且最简便的方法是使用特异性选择标记基因第五节遗传转化常用的选择标记基因及及无选择标记基因转化系50一、选择标记基因选择标记基因的特性：不存在于靶标植物细胞中的蛋白质或酶基因小，易于分子克隆可以利用表达元件在植物中充分表达检测容易，并且能够定量分析一、选择标记基因选择标记基因的特性：51抗Th素选择标记基因抗Th素选择标记基因52

除草剂选择标记基因除草剂选择标记基因53

安全选择标记基因安全选择标记基因54二、报告基因报告基因系指其编码产物能够被快速测定、常用来判断外源基因是否成功地导入受体细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因理想的报告基因的最基本要求：）受体细胞中不存在相应的内源等位基因的活性）它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞）具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测 特性二、报告基因报告基因系指其编码产物能够被快速测定、常用来判断55常用报告基因

-

葡萄糖醛酸糖苷酶（

GUS

）萤光素酶基因（

Luc

）绿色荧光蛋白（

GFP

）基因常用报告基因-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）56

-

葡萄糖醛酸糖苷酶（

GUS

）

:

编码酶的作用底物是无色的

X-

葡萄糖苷酸（

X-glucuronide), 将它变成深蓝色的

5-

溴

-4-

氯靛蓝在一定条件下与底物

X-Gluc

发Th作用，

产Th兰色沉淀反应，既可用分光光度计测定又可以直接观察植物组织形成的兰色斑点当加入

4-

甲基伞形酮基葡萄糖苷酸（

MUG

）

底物时，产Th

4-

甲基伞形酮，发荧光。因而可以用荧光光谱法测定-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）:编码酶的作用底57荧光素酶

Luc

基因

:最常用的是来自萤火虫的萤光素酶基因

,

在有氧的条件下，萤光素酶就会催化萤光素进行氧化反应，产Th

AMP

、

CO2

和黄绿色萤光荧光素酶Luc基因:最常用的是来自萤火虫的萤光素酶基58绿色荧光蛋白基因（

GFP

）

:

Vitoria来源于发光Th物水母（

Aequorea）体内的一种发光蛋白

在水母体内，水母蛋（

aequorin

）

与Ca2+

结合时会自发蓝光，

GFP

受此蓝光激发而发出绿色荧光

在实验室条件下，

用标准的长波长紫外光或者蓝光照射时，

GFP

受激发也能发出绿色荧光Movie

2绿色荧光蛋白基因（GFP）:Vitoria来源于发光59三 无选择标记基因转化系统（一）位点特异性重组（二）同源重组（三）共转化系统（四）转座子系统三 无选择标记基因转化系统（一）位点特异性重组60（一）

位点特异性重组系统位点特异性重组系统是指通过重组酶作用于两个特定

DNA

序列实现重组。该系统由重组酶及其识别位点组成，当两个识别位点正向排列时，重组酶可专一性地催化切除两个识别位点之间的序列。FLR

／

FRTS

重组系统Cre

／

LoxP

系统R

／

RS

系统FRT 是重组酶

FLP

的特异作用位点，

LoxP

位点是重组酶

Cre

的特异作用位点，

RS

是R

的识别位点。（一）位点特异性重组系统位点特异性重组系统是指通过重组酶作61

来源于

P1

噬菌体的

Cre

重组酶为

34.1KDa

，

由

4

个亚基组成（

2

个大的