基于金钗石斛麦冬提取物的保湿功效评价

基于金钗石斛麦冬提取物的保湿功效评价

中医认为，皮肤干燥、粗糙、无光等问题主要是由于肝肾阴虚、干热症气、肺脾功能丧失以及面部缺乏润养。金钗石斛（Dendrobiumnobile）具有滋阴清热、养胃生津、润肺止咳、益肾明目作用，且其气味轻清、甘滋轻灵、补而不腻，可以兼顾脾胃运化水液不足之弊端。麦冬（Ophiopogonjaponicas）则能养阴生津、润肺清心，被用于治疗热伤津液等。二者配合，药性协调而平和，滋阴润燥之力更胜。研究表明，水通道蛋白3(Aquaporin3,AQP3）负责水、甘油及尿素等物质的运输，其在保持表皮水合作用方面发挥重要作用，AQP表达量的变化、功能缺失可以影响皮肤屏障和导致皮肤干燥、弹性下降等皮肤损伤笔者通过体外培养永生化人皮肤角质形成细胞（HaCaT）、荧光定量PCR的方法对两者及其复配提取物的保湿功效进行研究，为其在化妆品中的应用提供依据。1试验部分1.1表皮细胞管理策略金钗石斛、麦冬（上海华宇药业有限公司）；永生化人皮肤角质形成细胞（HaCaT，博溪生物科技有限公司）；试验用水为去离子水；KcGrowth表皮细胞培养液（博溪生物科技有限公司）；PBS、MTT、DMSO、RNA提取试剂盒（Takara）；反转录试剂盒（Takara）；荧光染料（Takara）。CO1.2测试方法1.2.1金瓣石斛浓缩液的制备称取金钗石斛100g，以10倍质量去离子水煎煮提取2次，每次1h，浓缩处理，加入3倍体积的95%乙醇醇沉，过滤，取沉淀物定容至100g，即得金钗石斛浓缩液，生药质量浓度1g/mL；取麦冬100g，以10倍质量去离子水煎煮提取2次，每次1h，浓缩，加入3倍体积的95%乙醇醇沉，然后过滤，取滤液定容至100g，即得麦冬浓缩液，生药质量浓度1g/mL；称取金钗石斛浓缩液与麦冬浓缩液，以质量比1︰1、4︰3和3︰4复配，得到相对应的金钗石斛麦冬复配提取物，生药质量浓度1g/mL。1.2.2金饰石斛、天麻及其复配提取物的配制将HaCaT细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5%（体积分数）CO取对数生长期细胞消化后接种至96孔板，制备成细胞悬液。按照试验设计，用培养液稀释配制不同质量分数（10%、2%、0.4%、0.08%、0.016%、0.0032%、0.00064%和0.00013%）的金钗石斛、麦冬及其复配提取物。待细胞铺板率达到40%时进行给药，试验组加入不同浓度金钗石斛、麦冬及其复配提取物，调零孔（空白培养基对照）加入新鲜培养液，每组设3个复孔。培养板放置在37℃、体积分数5%CO1.2.3冬及其复配提取物形态学试验浓度根据实际检测的细胞毒性结果，确定金钗石斛、麦冬及其复配提取物形态学试验浓度。设立给药组与对照组，每组设两个复孔，按相应的接种密度接种细胞至24孔板中，37℃孵箱（体积分数5%CO1.2.4哈干因皮肤潮湿而对皮肤移植的分析将细胞以1.5×101.2.5统计处理比较试验结果采用“均值±标准差”表示，用MicrosoftExcel统计软件进行分析处理。两两比较采用t检验，P<0.05表示有显著性差异。实时荧光定量结果采用22结果与讨论2.1金瓣石斛/线性早熟-内酰胺提取物的质量分数对细胞活性的影响取不同质量分数的金钗石斛、麦冬及两者复配提取物分别处理HaCaT细胞24h后，MTT比色法检测细胞活性发现，金钗石斛提取物、质量比1︰1和4︰3的金钗石斛/麦冬复配提取物在质量分数0.4%、0.08%、0.016%、0.0032%、0.00064%和0.00013%时，对细胞活性无影响（P>0.05）。麦冬提取物和质量比3︰4的金钗石斛/麦冬复配提取物在质量分数0.08%、0.016%、0.0032%、0.00064%和0.00013%时，对细胞活性无影响（P>0.05）。参考MTT试验结果，选择相应质量分数，进行形态学检测。从图1～图5的试验结果照片可见，金钗石斛、麦冬和3种配比的金钗石斛/麦冬复配提取物均从质量分数0.4%开始，对细胞形态无明显影响，包括细胞的大小、形状结构、数量等均无明显改变。2.2金瓣石斛/天麻红外包的保湿功效基于HaCaT细胞活性影响试验结果，选择对HaCaT细胞活性和形态均无明显影响的质量分数条件，同时兼顾今后配方中添加应用的可行性，试验最终分别采用质量分数0.1%、0.05%和0.01%处理细胞，对AQP3、FLG和CAS14的mRNA表达量进行测定。AQP3对皮肤水合及屏障功能也起着重要作用，表皮细胞之间的水通道蛋白构成了细胞间水分输送的主要通路FLG参与人表皮角质形成细胞终末分化时细胞间交叉联结膜的形成，随着角质细胞成熟脱水，FLG分解生成大量的天然保湿因子，这对保持皮肤的水合作用和皮肤屏障十分重要CAS14具有组织特异性，是调节proFLG(Profilaggrin）去磷酸化成为FLG的关键酶，主要在维持表皮的稳态平衡中发挥重要作用图10列出了金钗石斛/麦冬（质量比4︰3）复配提取物对保湿相关基因表达影响PCR结果。从图10可以看出，质量比4︰3金钗石斛/麦冬复配提取物在质量分数0.1%时，对FLG、CAS14、AQP3的mRNA表达均有显著提升作用（P<0.05或0.01）。这一结果，同样说明了中药配伍所带来的成分变化和协同增效的作用，且配伍时药物之间比例的变化，也会导致功效的差异以往研究证实，金钗石斛与麦冬提取物均具有较好的保湿性能，这与本试验结果是一致的。所有试验结果不仅证实了这两种提取物以及两者复配物的保湿作用，且从对皮肤保湿相关基因表达的影响方面探究了其保湿的机理。金钗石斛、麦冬单味药的提取物，仅表现出对AQP3的促进作用，但将两者以不同比例复配后，对基因表达转录的调控就发生了改变，包括所影响基因种类的差异、上下调的改变和影响程度的变化，比如以质量比1︰1复配的提取物对CAS14的mRNA表达呈现下调的作用，而质量比3︰4复配物则表现为显著的上调作用；质量比4︰3复配物则对AQP3、FLG和CAS14三个基因的mRNA均有显著上调作用。这都提示了中草药配伍对于功效活性方面的影响，因为中药是遵循中医理论配伍，在合适的剂量配比之下，协同发挥作用3cas14基因表达水平的变化基因表达研究显示，金钗石斛、麦冬单药能够上调AQP3的mRNA表达，两者的复配提取物则表现出不同的调控作用，质量比1︰1复配物表现出对AQP3和FLG的促进作用，质量比