分析方法验证

液相色谱法方法验证岛津国际贸易（上海）有限公司分析仪器事业部分析中心为什么要进行方法验证？方法验证的目的

判断该方法是否科学、合理，是否能有效控制药品的内在质量。方法验证的流程

方法开发法规规定需要进行考察的内容制定验证实验计划(ValidationPlan)进行验证实验汇总和处理实验数据确认实验数据，填写验证报告。由质量负责人审批通过后以质量管理文件形式保存定期回顾，如有变更，确认是否需要进行再验证和如何进行再验证为什么要进行方法验证？方法验证的意义

药品的生产过程中，原料、中间体、成品均需进行检验，检验结果既是过程受控的依据，也是评价产品质量的重要依据，检验结果应准确可靠。而分析方法的验证为检验结果的准确性及可靠性提供了可靠保证。

※方法验证可以分成两种类型：

1）药典或注册分析方法的验证2）非药典或注册分析方法的验证

（一般为企业针对自身的产品而自行开发的方法）检测方法验证与确认方法验证（Verification）通过提供客观证据对规定要求已得满足的认定。方法确认（Validation）

通过检查并提供客观证据以证实某一特定预期用途的特定要求得到满足。确认是对验证的结果评价；验证注重“过程”，确认注重“结果”相关法规ICH

（用药品注册技术要求国际协调会）相关法规

ICHQ2（R1）、Q2A、Q2B药典

各国药典对分析方法验证均有具体的规定。2010版《中国药典》附录XIXA药物质量标准分析方法验证指导原则USP<1225>ValidationofcompendiamethodsFDA相关法规

《色谱方法验证审评指南验证》方法开发和方法验证的关系方法开发是实现方法验证的先行步骤

方法验证是检验方法开发是否成功的依据

方法开发阶段仍需要进行部分的方法验证的内容

-如：考察保留时间的重现性方法开发与方法验证的关系图

方法开发方法验证方法适用方法不适用验证不通过验证通过重新进行方法开发，并检讨方法开发流程确定为SOP方法验证的前提条件仪器：仪器设备经过验证和校正，且在有效期内人员：经过充分的培训，熟悉方法以及所使用的仪器物料：使用符合相关规定的物料（包括标准品、试剂、容器等）方法：该分析方法的开发和优化已经成功完成，并且已经考察其耐用性。环境：试验环境符合该分析方法的要求。（洁净度、温度、湿度等）方法验证计划如何制定？方法验证的技术要素准确度（回收率）精密度专属性检测限定量限线性范围耐用性

不同的分析方法对验证项目的要求：验证项目鉴别杂质定性杂质定量测定含量溶出度等准确度--+++精密度—重复性--+++精密度—中间精密度--+++专属性+++++检测限-+---定量限--+--线性--+++范围--+++耐用性+++++拟定验证计划根据分析方法确定验证项目明确各验证项目需要进行何种实验明确各验证项目负责人的责任确定各验证项目的完成期限汇总成验证计划，请质量负责人或者检验实验室负责人审核批准验证计划批准生效，须制成正式文件存档备查，同时正式开始方法验证

准确度（Accuracy）准确度，是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度；表示分析方法的正确性。由于“真实值”无法准确知道，因此，通常采用回收率（%）来表示。涉及到定量测定的检测项目均需验证准确度，如杂质定量检查，含量和溶出方法，分析方法的准确度能够确保：

1）样品中的待测物全部溶解2）待测物全部从检测器中检出如何进行准确度的验证？准确度的测定至少选取包括标准浓度在内的至少3个浓度级别（通常选取80%、100%和120%），每个浓度级别至少测定3次，计算测定结果的回收率。

1）原料药

a）用已知纯度的对照品或符合要求的原料药进行测定；

b）用所得结果与已通过验证的另一方法测定的结果进行比较。2）制剂a）用含有已知量被测物的各组分混合物进行测定；b）如无法得到制剂的全部组分，可采用加样回收试验法；

c）用所得结果与已通过验证的另一方法测定的结果进行比较。

3）杂质

a）用已知纯度的对照品或符合要求的原料药进行测定；

b）用所得结果与已通过验证的另一方法测定的结果进行比较。

回收率（Recovery）测定回收率R的具体方法可采用：“回收试验法”和“加样回收试验法”回收试验空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M

加样回收试验已准确测定含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M回收率（Recovery）对于检测的禁用物质，回收率应在方法测定低限、两倍方法测定低限和十倍方法测定低限进行三水平试验（n=3）；对于已制定最高残留量（MRL）的样品，回收率应在方法测定低限、MRL、选一合适点进行三水平试验；在加样回率收试验中须注意标准品的加入量与样品被测组分含有量之和必须在标准曲线线性范围内；应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率(％)计算值，以及回收率(％)的相对标准偏差(RSD)回收率（Recovery）准确度的接受标准1）含量和溶出：

a）各浓度下的平均回收率应在98.0%-102.0%之间b）9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%c）中药检品一般应满足：回收率计算值在95%-105%范围2）杂质杂质含量水平接受标准≤0.2%绝对值±0.05%0.2%-1.0%相对值±20%＞1.0%相对值±10%指在规定测试条件下，同一均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间接近的程度。用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV）表示。精密度（Precision）精密度（Precision）重复性（Repeatability）在相同的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定结果的精密度；中间精密度（Intermediateprecision)同一实验室不同日期、不同仪器不同分析人员对同一样品测定结果的精密度，重现性（Reproducibility）

在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。重复性（Repeatability）是指在同一条件下对同一批样品，从样品液制备开始，制备至少六份以上供试品溶液(即n≥6),或设计3

个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试溶液，进行测定，计算其含量的平均值和相对标准偏差RSD。接受标准：原料药方法验证时，活性成分的RSD≤1.0%；制剂方法验证时，活性成分峰RSD≤2.0%；杂质方法验证是，每个杂质峰RSD≤20%；中间精密度（IntermediatePrecision）同一批样品每位分析人员准备六份进行测量，计算两人之间平均值的差异。

接受标准：原料药方法验证时，平行六份样品的RSD≤1.0%，两人之间的平均值之差≤1.0%；制剂方法验证时，平行六份样品的RSD≤2.0%，两人之间的平均值之差≤3.0%；杂质方法验证是，平行六份样品的RSD≤20%，两人之间的平均值之差如下表：杂质含量水平接受标准≤0.2%绝对值±0.05%0.2%-1.0%相对值±20%＞1.0%相对值±10%重现性（Reproducibility）是指在不同的实验室由不同分析人员测定结果的精密度。当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。如建立药典分析方法时，通过协同检验得出重现性结果，协同检验及重现性结果均应记载在起草说明中。一般实验室不进行此项考察。准确度和精密度关系A

准确度好，精密度好B

准确度差，精密度好C

准确度好，精密度差D

准确度差，精密度差指在其他成分（如杂质、降解物、辅料等）可能存在下，采用的分析方法能够正确鉴定、检出被分析物质的特性通常，鉴别、杂质检查、含量测定方法中均应考察其专属性。如果采用的方法专属性欠佳，应采用多个方法予以补充。专属性（

Specificity

）应当证明潜在的干扰成分不会对方法的性能产生负作用。对于色谱方法，要求证实杂质之间、杂质与主峰之间的选择性；分离度≥1.5，如果有充分的证据证明确实可行，某些情况下分离度低于1.2也可以接受。空白对照应无干扰。专属性的接受标准检测限（limitofdetection，LOD）

检测限，是指试样中被测物能被检测出的最低量。检测限是一种限度检验效能指标，即反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白(本底)值的高低。可用已知低浓度样品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以S/N＝3时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限。检测限的报告数据应附图谱，说明测试过程和检测限结果。

定量限（1imitofquantitation，LOQ）定量限，是指在保证一定准确度和精密度的前提下，样品中被测物能被定量测定的最低量。常用信噪比法测定定量限。一般以S/N＝10时相应的浓度或注入仪器的量进行确定。也可用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值，再经试验确定。应附典型图谱线性（linearity）线性，在设计的范围内，测试结果与试样中被测物质浓度呈线性关系的程度。线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，均需要验证其线性。应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，制备一系列供试品的方法进行测定，至少制备5个浓度（通常选择50%、80%、100%、120%、150%）。以测得的响应信号对被测物浓度作图，用最小二乘法进行线性回归。回归方程的相关系数r

越接近于1，表明线性关系越好。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算，并说明依据。线性数据要求回归方程；相关系数R是相关系数（correlationcoefficient）表示说两个变量变化的共同趋势有多少；R2称为确定系数（determinationcoefficient）意思是一个变量的变化有百分之多少可以由另一个变量来解释。两者都是用于检验的，但前者是用于检验两变量间线性相关程度，后者用于检验模型的拟合效果，这个模型不一定是y=bx+a型的。线性图线性的接受标准含量类型相关系数截距含量方法R≥0.9997，或R2≥0.999≤2.0%定量杂质方法R≥0.995，或R2≥0.990≤20%范围范围指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。杂质定量检查、含量和溶出方法均应验证其范围，分析方法的范围应根据具体分析方法以及对线性、准确度、精密度的结果和要求确定。范围通常用于分析方法测试结果相同的单位（如百分浓度）表达。涉及到定量测定的检测项目均需要对范围进行验证，如含量测