基于srap的国兰种质资源遗传多样性分析及分子指纹图谱构建

基于srap的国兰种质资源遗传多样性分析及分子指纹图谱构建

0型花地生兰中国南方地区“研究意义”兰花是中国兰花，也被称为东路兰或东路兰，是兰科植物科的一种小型花卉植物。主要分布在中国南方，以及日本、韩国、泰国和其他地区。传统意义上的国兰主要包括春兰(Cymbidiumgoeringii)、春剑(C.longibractium)、蕙兰(C.faberi)、建兰(C.ensifolium)、寒兰(C.kanran)、墨兰(C.sinense)和莲瓣兰(C.lianpan)等7种1材料和方法试验于2012—2013年在华侨大学花卉工程研究所进行。1.1材料和样品采集本试验共收集139份国兰样本(表1),其中包含春兰品种31个,建兰品种14个,墨兰品种29个,寒兰品种7个,春剑8个,莲瓣兰品种12个,蕙兰品种11个,杂交品种9个,野生兰18份。2012年9月—2013年10月,材料分批采自华南植物园、远东国兰有限公司,福建南靖丰田兰园、云南大理点苍山、云南曲靖大海草山等地。栽培品种采用随机采样,每份样本采集一个品种不少于20个成年株,对数量少于20株的品种进行全采;野生兰根据种群采样,不同种群主要根据地理分布、密度和年龄结构特点等进行界定,大的种群随机采集不少于20个成年个体作为一份样本,不足20个个体的种群进行全采样作为一份样本,共采集到18份。样本均经核实并鉴定,凭证标本保存于华侨大学植物生物技术实验室。1.2数据统计分析1.2.1基因组DNA的提取与检测以国兰叶子为材料,采用改良的CTAB法1.2.2SRAP-PCR引物筛选及其检测参考Budak等1.2.3数据统计分析对SRAP-PCR扩增产物电泳胶图进行人工读带,以DGL2000Maker为分子量标准,对扩增条带按有(1)或无(0)进行统计,建立二元数据矩阵。计算多态性引物的总扩增条带数、多态性条带数和多态性条带比率。按照Botstein公式计算多态信息含量(polymorphisminformationcontent,PIC);用POPGENE32软件计算观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon’s信息指数(I)。用NTSYS-pc2.10e软件UPGMA方法进行聚类分析构建聚类图,并计算遗传相似性系数(GS)。从17对引物组合扩增的图谱中筛选出多态性好、清晰、鉴别效率高的图谱,构建139份国兰种质资源数字指纹图谱,根据指纹图谱出现的概率公式P=1/22结果2.1ssap扩增多态性分析从208对引物中筛选出17对能扩增出较多特异性条带、且条带清晰的引物。图1为引物对Me12/Em8对139份供试样本的SRAP-PCR扩增图谱。17对引物对139份国兰种质进行SRAP扩增,共扩增出489条清晰条带,DNA片段长度在100—2000bp;不同引物的扩增带数从20—36条不等,引物M12-E8扩增的条带最多,为36条,引物M1-E5扩增的条带最少,为20条,平均每对引物获得DNA谱带29条;在489条扩增带中,多态性条带484条,平均多态性条带百分率为98.89%,显示SRAP在国兰种质资源遗传多样性研究中具有高效性。PIC值是衡量引物合适程度的重要指标,可以反映引物揭示信息量的多少,PIC值越高包含的信息量越大,当PIC>0.5时,引物为高度多态性信息引物。在供试材料中,17对SRAP引物检测到的PIC值为0.9137—0.9566,均为多态性引物。可见所筛选出来的引物均为高度多态性信息引物,反映了供试国兰种质具有较高的基因多样性水平(表2)。2.2和时期野生兰种质组成139份国兰种质资源的遗传相似系数变化范围为0.51—0.91。在相似系数为0.70时,所有供试样本可划分为6个类群(图2)。其中,Ⅰ类群包括全部供试春兰共31份样本,聚类结果基本与形态学划分春兰品种相一致,类群内种质相似程度较高,谱系清晰。Ⅱ类群包括42份样本,涵盖了几乎全部供试的建兰和墨兰品种,仅个别品种差异,且在相似系数0.70左右又可细分为IIa和IIb两个亚类;Ⅲ类群包含了墨兰品种‘金玉满堂’、供试的大部寒兰品种、蕙兰品种、杂交兰品种及18份野生兰全部共44份样本,在相似系数0.71处又可细分为Ⅲa和Ⅲb两个亚类;Ⅳ类群包括了供试春剑品种大部和莲瓣兰品种全部共19个样本,说明两种系资源亲缘关系较近。在相似系数0.76处可细分为Ⅳa和Ⅳb两个亚类;V类群仅包括细叶寒兰和大根寒兰2个品种。VI类仅‘彩虹’一个品种,并且较早从基部分离,与其他种系的关系难以判断,其真实的谱系还有待进一步确认。2.3国兰种质资源的鉴定一般可以通过特异谱带和多个引物组合2种方法来鉴定种质资源。由于国兰供试种质多态性引物对筛出率较低(8.2%),仅获得17对多态性引物,而且单个引物对扩增出的特征条带少,不足以鉴别所有供试材料,所以采用全17引物组合方式鉴定供试国兰种质资源具有较高的效率。从17对引物组合(M1/E4、M1/E5、M1/E8、M1/E15、M4/E6、M5/E1、M5/E2、M5/E11、M5/E12、M6/E7、M12/E5、M12/E7、M12/E8、M13/E1、M13/E6、M12/E2、M5/E15)扩增的图谱中筛选出多态性好、鉴别效率高的图谱,使之数字化,构建139份国兰种质资源数字指纹图谱(图3)。17对引物组合48条谱带构建而成139份国兰种质资源的分子身份证,根据概率公式1/23讨论3.1蓝草资源的遗传多样性SRAP-标记是由美国科学家Li等3.2春兰传统栽培品种多样性分析SRAP标记的UPGMA聚类分析结果表明,供试139份样本可以清楚地被区分开来。在遗传相似系数0.70水平,样本可划分为6个类群。其中Ⅰ类群由春兰种系单独构成,谱系清晰,并与经典形态分类结果相一致,说明春兰传统栽培品种保持了良好的纯合性,但遗传基础相对较为狭窄。从Ⅱ类群的聚类结果看,说明建兰与墨兰两大种系具有较近的亲缘关系,这一结果不仅与形态学分类结果基本一致,还与孙彩云等3.3srap扩增效果分析通过DNA分子标记来鉴别品种资源是较为准确而有效的方法,也是数字化身份证构建的有效工具,这已在大量的种质资源研究中得到应用本研究选择了包括目前国兰体系中7个主要栽培种系品种及部分杂交品种共121个,另还收集了18份野生种群样本,首次利用SRAP标记进行系统的分子鉴定、图谱及数字化身份识别体系构建研究,结果显示SRAP标记可将所有供试样本清晰地区分开来,而应用17对SRAP引物扩增所获图谱构建的139份样本的数字身份证,置信率达99.99%。说明本研究所选引物足以区分亲缘关系很近的不同材料,利用SRAP标记进行国兰种质分子鉴定、图谱及数字化身份识别体系构建等具有较强的可靠性。不过本研究中SRAP多态性引物的筛出率仍偏低,一般来说,影响引物筛出率的因素大概有两方面:一是实验性的,如引物特异性、实验操作环境、扩增体系等;一是方法本身的,由于SRAP是对ORFs进行扩增,因而对基因组相对较少的着丝粒附近以及端粒的扩增会较少。就本研究而言,最大的可能性是因采用了通用性的引物,其特异性不足。当然其具体原因还有待后续的研究证实。4国兰分子身份证构建采用SRAP分子标记分析国兰遗传多样性,扩增条带多态性(PPB)比