乙肝疫苗的生产工艺专家讲座

乙肝疫苗是用于预防乙肝特殊药品。疫苗接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗体，这种抗体存在于人体液之中，乙肝病毒一旦出现，抗体会马上作用，将其去除，阻止感染，并不会伤害肝脏，从而使人体含有了预防乙肝免疫力，从而到达预防乙肝感染目标。接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染最有效方法。

乙肝疫苗的生产工艺专家讲座第1页基因工程乙肝疫苗是乙肝表面抗原（HbsAg）亚单位疫苗，它系采取当代生物技术将乙肝病毒表示表面抗原基因进行质粒构建，克隆进入啤酒酵母菌或CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）中，经过培养这种重组酵母菌或CHO细胞来表示乙肝表面抗原亚单位。发酵后经过细胞破碎和一系列微滤、超滤、硅胶吸附、洗脱等工序，再经过疏水层析，可使产品抗原蛋白纯度达99%以上。乙肝疫苗的生产工艺专家讲座第2页乙肝疫苗制造工艺1.目标基因获取2.工程菌构建3.目标基因表示4.蛋白质分离纯化乙肝疫苗的生产工艺专家讲座第3页

目标基因获取编码乙型肝炎表面抗原基因获取普通目标基因获取方法有：反转录法化学合成法反转录—聚合酶链反应法工程菌构建CHO(中国仓鼠卵巢）细胞特点①含有准确转录后修饰功效,表示糖基化药

物蛋白在分子结构、理化特征和生物学功效方面最靠近于天然蛋白分子②含有产物胞外分泌功

能,便于下游产物分离纯化;③含有重组基因高效

扩增和表示能力;④含有贴壁生长特征,且有较高

耐受剪切力和渗透压能力,能够进行悬浮培养,表示水平较高;⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibrob2last),极少分泌本身内源蛋白,利于外源蛋白后分离目标基因表示蛋白质分离纯化

细胞破碎→固液分离→浓缩与初步纯化→高度纯化→成品加工乙肝疫苗的生产工艺专家讲座第4页生产工艺控制基因工程乙肝疫苗生产工艺包含发酵、提取、纯化、吸附、配制、分装等工序。生产工艺中采取世界一流发酵罐，经过全自动控制，提供酵母菌最优生长条件，发酵后经过细胞破碎和一系列微滤、超滤、硅胶吸附、洗脱等工序，再经过疏水层析，可使产品抗原蛋白纯度达99%以上全部工艺设备可自动清洗、自动灭菌，有效地降低了种种人为原因干扰，确保生产稳定和质量一致性。乙肝疫苗的生产工艺专家讲座第5页蛋白质分离纯化

乙肝疫苗的生产工艺专家讲座第6页细胞破碎

微滤

超滤

发酵结束后，经过过滤或离心，使酵母与发酵液分离，然后细胞经过高压匀浆机破碎，释放出抗原。酵母细胞壁较厚，比大肠杆菌难破碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压力，经过针形阀突然降压到零，使细胞破碎。在细胞破碎前加入蛋白酶抑制剂以防抗原被分解。细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。粗细胞裂解物用0.2um中空纤维柱进行微滤。抗原和大部分低分子量宿主细胞内含物经过滤膜，细胞碎片被膜拦截。滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子量宿主细胞内含物经过滤膜除去。乙肝疫苗的生产工艺专家讲座第7页疏水柱层析介质：ButylSSepharoseFF加入适量硫酸铵，调整电导率与柱层析平衡液电导率相等按照平衡柱床、上样吸附、平衡液洗柱、降低硫酸铵浓度解析、清柱再生程序层析阴离子交换柱层析介质：DEAESepharoseFFHBsAg活性蛋白经SephadexG-25柱脱盐换液，使缓冲盐系统PH、离子强度和IEC平衡液一致按照平衡柱床、丄样吸附、氯化钠浓度梯度分段洗脱、清柱再生程序层析凝胶过滤柱层析介质：Sepharose4FF超滤浓缩到适当体积按照平衡柱床、丄样、洗脱程序层析乙肝疫苗的生产工艺专家讲座第8页

无菌过滤氢氧化铝共沉淀

分装纯化后抗原再与氢氧化铝共沉淀，在共沉淀时，抗原吸附在氢氧化铝上。疫苗稳定性较差，普通在2~8℃下能保留12个月，但当温度升高后，效力很快降低。在37℃下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输。为了使疫苗稳定性提升，可用冻干方法使之干燥。收取到HBsAg除菌过滤，即为纯品乙肝疫苗的生产工艺专家讲座第9页临床应用乙肝疫苗自1979年问世以来，经过20多年大规模应用和观察，至今还未见到相关注射后引发严重不良反应报道，只有少数人出现接种部位红肿、硬结、疼痛、手臂酸重或发烧、恶心、呕吐、乏力、皮疹等与普通疫苗接种大致相仿轻微反应，多于1-3天内不治自愈。因为乙肝疫苗属血源性，在制备过程中纯化与灭活程序十分严密，故不会产生像破伤风等动物血清