黄芪的遗传毒性及亚慢性毒性试验研究

黄芪的遗传毒性及亚慢性毒性试验研究

根据中国的法典，黄鼠尾是蒙古的黄鼠尾。蒙古的黄鼠尾草。黄芪的药用迄今已有2000多年的历史,其有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用,具有很高的药用价值和保健功能1材料和方法1.1材料表面1.1.1料液比的提取黄芪由山西振东制药股份有限公司提供,黄芪原料呈圆柱形,表面淡棕黄色或淡棕褐色。实验前取黄芪原料按照料液比为1∶12的比例,加水浸泡30min,在微沸状态下提取2次,合并提取液,过滤;滤过的残渣用75%的乙醇,按照料液比为1∶10的比例,回流提取2次,合并提取液,过滤。将水提和醇提的滤液合并,在70℃~75℃、-0.07Mpa~-0.08Mpa的条件下浓缩,对浓缩液进行微波干燥、粉碎,制成提取物待用,1g提取物相当于3.1g原料。1.1.2急性经口毒性试验项目,性别和体质量试验用ICR小鼠由浙江省实验动物中心提供。体质量:18g~22g,雌雄各半,用于急性经口毒性试验;体质量:25g~30g,雌雄各半,用于遗传毒性试验。饲养温度:20℃~25℃,饲养湿度:40%~70%1.1.3蘑菇细菌回复突变试验选用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌,共4株,即TA1.2仪器、试药和仪器TEK8530全自动五分类血液分析仪(江西特康科技有限公司,中国);XL1800血凝仪(上海迅达医学科技有限公司,中国);蓝韵LWC400全自动生化分析仪(深圳蓝韵实业有限公司,中国);XD685电解质分析仪(杭州众驰科技有限公司,中国);尿液分析仪(桂林优利特医疗电子有限公司,中国);YZ11D检眼镜(苏州六六视觉科技股份有限公司,中国)。2-乙酰氨基芴(Sigma-Aldrich公司,批号:STBF2332V);1,8-二羟基蒽醌(Sigma-Aldrich公司,批号:WXBC4791V);叠氮钠(中国北京鼎国生物技术有限责任公司,批号:81G10150);敌克松(Chemservice公司,批号:285-75B);丝裂霉素C(Roche公司,批号:M0308A);环磷酰胺(SigmaAldrich公司,批号:MKBS0021V);秋水仙素(SigmaAldrich公司,批号:J1210A)。1.3方法1.3.1急性口腔毒性试验1.3.1.灌胃前后小鼠的耐胃能力按限量法设提取物20.0g/kgBW一个剂量组。称取提取物20g,以1%羧甲基纤维素钠为溶媒配制成40ml样品液。小鼠灌胃前禁食(不禁水)6h,按20ml/kgBW灌胃容量灌胃2次,间隔4h。末次灌胃2h后动物自由进食、饮水。1.3.1.灌胃前后大鼠的前药物药物代谢按限量法设提取物20.0g/kgBW一个剂量组。称取提取物300g,以1%羧甲基纤维素钠为溶媒配制成450ml样品液。大鼠灌胃前禁食(不禁水)6h,按10ml/kgBW灌胃容量灌胃3次,间隔4h。末次灌胃3h后动物自由进食、饮水。1.3.2细菌回复突变试验试验采用平板掺入法,选择试验浓度为8μg/皿、40μg/皿、200μg/皿、1000μg/皿、5000μg/皿5个剂量组。1.3.3小鼠提取物制备试验小鼠随机分为5组,每组10只,雌雄各半,分别设为阴性对照组(1%羧甲基纤维素钠)、阳性对照组(环磷酰胺)、2.5g/kg、5.0g/kg、10.0g/kg剂量组。按20ml/kgBW灌胃量经口灌胃给予小鼠提取物,灌胃2次,间隔24h。第2次灌胃后6h处死动物,取胸骨骨髓制片,干燥固定,Giemsa染色。1.3.4秋水仙素酯类化合物环磷酰胺盐酰胺2次注射小鼠随机分为5组,每组5只。设2.5g/kg、5.0g/kg、10.0g/kg3个剂量组。另设一个阴性对照组(1%羧甲基纤维素钠)和一个阳性对照组(环磷酰胺40mg/kgBW,称取环磷酰胺80mg,加生理盐水溶解至40ml,单次腹腔注射)。各剂量组小鼠按20ml/kgBW灌胃容量经口灌胃给予提取物,连续5d,每天1次。各组均于第一次给予提取物后的第13d将小鼠处死采样。小鼠处死前5h腹腔注射秋水仙素6mg/kgBW。用颈椎脱臼法处死小鼠,取两侧睾丸,低渗处理,分离曲细精管,吹打静置,以固定液固定2次,常规离心,去上清液后于低温环境下滴片,自然干燥,Giemsa染色。1.3.5动物饲养及检测试验用SD大鼠适应性喂养后,按体质量随机分组,设1个阴性对照组(基础饲料)和3个提取物剂量组:2.0g/kgBW、4.0g/kgBW、8.0g/kgBW(相当于黄芪6.2g/kgBW、12.4g/kgBW、24.8g/kgBW);在阴性对照组和高剂量组添加卫星组。将提取物按体质量8%折算掺入饲料中喂养,大鼠自由进食、饮水,连续观察13周,每周记录体重和进食量并计算食物利用率,试验中期对卫星组大鼠进行尿常规检测,禁食过夜,腹主动脉采血测定血常规及血生化指标;试验末期所有大鼠进行尿常规检测,禁食过夜,腹主动脉采血测定血生化及血常规指标,解剖动物观察各脏器大体改变,摘取脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、睾丸/卵巢、附睾/子宫、肾上腺、胸腺测定湿重,计算脏体比;取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、垂体、甲状腺、胸腺、胃、十二指肠、胰脏、空肠、回肠、结肠、直肠、膀胱、淋巴结、肾上腺、前列腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫进行病理组织学观察,脏器石蜡切片,苏木素-伊红(HE)染色。1.4统计处理采用SPSS统计软件统计,计量资料采用配对t检验,计数资料采用χ2结果2.1急性口腔毒性试验以20g/kgBW剂量的提取物对大小鼠进行试验后未见明显中毒症状。黄芪提取物对雌雄大小鼠的经口LD2.2回复突变试验对TA97、TA98、TA100、TA1024株试验菌株,不同浓度提取物在加和不加S9条件下的回变菌落数与阴性对照组近似,而阳性对照组回变菌落数均高于阴性对照组回变菌落数2倍以上。黄芪提取物细菌回复突变试验检测结果为阴性,重复试验仍得出相同结果。2.3各组大鼠血清中血清型马来安氏氏菌性别的比较黄芪提取物哺乳动物红细胞微核试验阳性对照组微核发生率(雄性2.12%,雌性2.08%)明显高于阴性对照组(雄性0.22%,雌性0.22%),差异有统计学意义(P<0.01),而各剂量组(雄性0.25%~0.27%,雌性0.25%~0.28%)与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组PCE/RBC比值均在正常范围内,表明黄芪提取物对哺乳动物红细胞微核未见明显影响,检测结果为阴性。2.4各组染色体异常细胞率黄芪提取物各剂量组染色体异常细胞率(0.6%)与阴性对照组(0.8%)比较并无明显变化(P>0.05),差异无统计学意义;而阳性对照组染色体异常细胞率(9.2%)明显高于阴性对照组染色体异常细胞率(0.8%)(P<0.01),差异有统计学意义。表明黄芪提取物对小鼠精母细胞染色体畸变发生率未见明显影响,检测结果为阴性。2.590d口腔毒性试验2.5.1一般观察试验期间,各剂量组大鼠未见异常症状和体征,也无死亡。2.5.2影响大鼠体重的增加、总食入量和总食物利用率由表1可见,在整个试验期,提取物各剂量组雌、雄大鼠的增重及食物利用率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.5.3对大鼠血常规及血生化指标的影响由表2、表3可见,雄性高剂量组大鼠ALT、TG指标明显低于阴性对照组(P<0.05),其余各剂量组的雌雄大鼠在试验中所测得的血常规指标及血生化指标均在正常范围。2.5.4病理组织学检测由表4可见,各剂量组雌性和雄性试验大鼠的脏器重量与阴性对照组比较,结果差异无统计学意义(P>0.05)。病理切片显微镜检发现:阴性对照组8只雄鼠、10只雌鼠,高剂量组8只雄鼠、7只雌鼠可见轻度肾小管扩张;阴性对照组2只雄鼠可见轻度肾间质淋巴细胞浸润;阴性对照组1只雄鼠可见轻度肾小管再生;阴性对照组1只雄鼠可见轻度附睾炎;阴性对照组3只雄鼠,高剂量组2只雄鼠可见轻度前列腺炎。高剂量组雌、雄大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、垂体、甲状腺、胸腺、胃、十二指肠、胰脏、空肠、回肠、结肠、直肠、膀胱、淋巴结、肾上腺、前列腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫均未见明显与试验因素有关的病理组织学变化。黄芪提取物对试验大鼠大体解剖、组织学观察未见明显影响。3保护剂为中药制剂的安全性评价黄芪属于中医传统的补虚药,历