牛肌腱胶原纤维提取工艺优化及其结构表征

牛肌腱胶原纤维提取工艺优化及其结构表征

1胶原纤维的作用胶原纤维是细胞外基质的主要骨架成分。广泛存在于皮肤、骨骼、肌腱等领域，起到了支持和保护的作用。胶原纤维是原胶原分子的聚集体,在结缔组织中排列成束,彼此交织。原胶原分子间通过侧向共价交联,相互呈阶梯式有序排列聚合成直径50～200nm、长280nm至数微米的原纤维,这些原纤维组成胶原纤维。相比胶原分子,除拥有胶原的四级结构外,保留有更多的天然胶原空间结构特征,因而其具有很好的抗张强度、韧性。当制成海绵时,由于胶原纤维分子量更大,空间结构更复杂,遇到体液时,不易流失、变形和降解,稳定性更高。胶原纤维作为生物材料前景广阔,目前已应用于临床的有组织工程支架,止血、抑菌海绵等。多年来提取胶原纤维的方法比较少,多以酸溶、盐析提取本文以牛肌腱为原料,利用酸-酶结合浸提胶原纤维,实验采用正交设计法,通过比较不同浸提时的时间、酶用量、pH值下产物的提取率及可溶性蛋白含量,从而获得最佳工艺,并对最优条件下提取的胶原纤维进行结构表征。22.1仪器、试剂与仪器胃蛋白酶(1∶3000),Sigma公司;冰乙酸(分析纯),上海有机化工试剂研究所;新鲜牛肌腱,成都郭家桥市场;高速离心机LG10-24A,北京医用离心机厂;冷冻干燥机FreeZone6,美国Labconco公司;SZ-2自动双重纯水蒸馏器,上海沪西分析仪器厂;差示扫描量热仪,DSC2000PC,德国耐驰公司;傅里叶红外光谱仪MAGNAIR560,美国Nicolet公司;原子力显微镜,SPM9600,日本Veeco公司;JSM-5900扫描电镜,LV日本电子株式会社。2.22.2.1双蒸和丙酮浸泡将新鲜牛腱洗净,剔除肉质、血管及边缘软骨,并尽量除去表面筋膜,切成1mm的薄片,用75%的乙醇浸泡24h,用双蒸水多次漂洗,再用丙酮浸泡24h脱脂,双蒸水洗净,风干。称取一定量冷冻干燥后的牛肌腱,加入一定量的双蒸水,4℃恒温条件下用切碎机打碎、匀浆,每次匀浆时间为30min,直至组织悬浮不见组织碎片为止,置于冰柜4℃冷却。2.2.2酶法提取胶原纤维酶法水解的影响因素主要有酶用量、水解pH值、水解时间以及水解温度。根据前期研究的成果2.2.3离心沉淀沉淀将初提物在10000r/min离心30min,去除上清液。在沉淀中加入双蒸水,匀浆,以1mol/LNaOH调节溶液的pH值为7.0左右,4℃静置过夜。10000r/min离心30min,去除上清液。在沉淀中加入一定量的10mmol/LHCl溶液,摇荡后4℃放置过夜。匀浆,加入1/10体积的0.2mol/LNa2.2.4搅拌和搅拌时称取一定量的胶原纤维样品,将其溶于pH值为2.0的醋酸溶液中制成凝胶,搅拌过夜。次日低温离心30min,转速10000r/min,取上层清液,再用凯氏定氮法测定溶液可溶性胶原蛋白含量。水分含量测定采用烘箱法,准确称取一定量的胶原纤维,于100～105℃干燥至恒重,计算水分含量2.3dsc分析对优化条件下提取的胶原纤维进行结构表征,应用SDS电泳检测样品的分子量及分布,用DSC分析样品的纯度及热稳定性,通过FT-IR分析表征样品的三股螺旋结构,应用SEM、TEM分析胶原纤维的空间结构及组成等。33.1ph值和酶用量对提取率的影响以产率为评价指标,对正交试验结果进行分析评价,结果如表1所示。从表1可见,各因素对提取率影响次序依次为时间、pH值、酶用量。由于牛肌腱胶原纤维编织的比较紧实,时间太短使得酶对胶原纤维凝胶水解不充分,不足以将端肽链段去除,也不能将一些交联键打断,使得后续的中和不能使胶原纤维析出。溶液pH值过低,使胶原过度水解生成较多的多肽,在操作过程中易损失掉,使得产率降低;同时pH值太低,酶的活力受到抑制,影响酶的作用。而当pH值较高时酶的活性稍低,胃蛋白酶不能发挥最大水解能力,产率也受到抑制。适量的胃蛋白酶可以使酶促反应朝正反应方向移动,酶用量过低,则不足以使底物深入反应,就不能充分地作用,使得在离心中牛肌腱以不溶物被滤去,提取率下降;而当酶浓度较高时,反应液中水解出的胶原蛋白的量、非胶原蛋白的量随着反应的进行等逐渐增多,导致提取率下降。因为胃蛋白酶活性很高,在适宜条件下,只需较少的量就能发挥很大的作用,故酶用量影响最小。以可溶性蛋白为评价指标,实验利用凯氏定氮法反复测定可溶性蛋白含量,结果均为零,说明胶原纤维不含可溶性蛋白,提取过程基本没有小分子产物,纯度较高。烘箱法测定含水量为25.70%,说明冷冻干燥后的胶原纤维还含有一定量的水分,估计这部分水与胶原纤维发生化学结合,较难除去。从图1不难看出,就提取率和可溶性蛋白含量来讲,在温度4℃,提取牛肌腱胶原纤维最佳工艺为:胃蛋白酶用量1.0%,pH值为2.5,时间40h,提取率最高。3.2电泳图从图2中可以明显看出电泳图含有4个谱带,分别是胶原的α3.3酰胺、带和带胶原纤维的特征吸收峰明显,主要有酰胺Ⅰ、Ⅱ带和Ⅲ带等3处。从图3可见,样品在1656.16cm3.4变性温度对胶原纤维生物特性的影响热变性温度是其天然生物材料的一项重要指标,不同的物质它们的特征峰也不同。当环境温度超过其变性温度,胶原纤维的天然螺旋结构被破坏,其生物学性能也随之消失或受到破坏。由图4可见,样品中共有两个峰,分别出现在66.7和90℃附近。第1个峰为胶原纤维的热变形温度,与文献3.5定孔径的三维网状结构由图5可见,胶原纤维经冷冻干燥后形成具有一定孔径的三维网状结构,孔径约为100～300μm。同时还可以清晰地看到较多的胶原纤维束,其直径大约100～200nm不等。3.6纤维束结构与原纤维截面的分布胶原纤维是胶原分子的聚集体,根据Schmitt等提出,胶原分子不仅侧向聚集,而且轴向延伸,侧向聚集的平行排列的胶原分子并不是齐头齐尾,而是相互前后错开一定的距离,交错距离就是周期性明暗横纹的间距,大约为67nm,这种特殊的横纹是区分胶原跟胶原纤维最有力的证据。胶原分子构成原纤维,原纤维有特殊的明暗相接的横带,相邻原纤维之间紧密排列,明暗横纹相互对应;原纤维又构成基础纤维,胶原纤维缠绕编织形成纤维束,纤维束的次级结构是基础纤维。基础纤维表面存在有由原纤构成的束带,其断面不太规则,但曲面较为光滑由图6～9可见,所得胶原纤维以多种状态存在,包括单根纤维(图8、9)、纤维束(图7)和网状编织(图6)。单根纤维可以见到相似明暗相间的横纹结构,横纹间距大约60.35nm(图9、表3)。纤维断面形状不太规则,但曲面较为光滑,以椭圆较为多见,而且编织紧密,相互重叠(图8)。这些纤维在一定时间、温度等条件下,发生自聚集作用,最后形成网状编织结构4胶原纤维的形态结构(1)在4℃下,酶法提取牛肌腱胶原纤维的最优条件为:胃蛋白酶(1:3000)用量1.0%,pH值2.5,水解时间40h。(2)提取率较文献报道的有