通脉颗粒的药理作用及临床应用研究

通脉颗粒的药理作用及临床应用研究

总脉（片剂）记录在《卫生部药物标准》中的《中药方针剂》（第四卷）中。丹参、川芎、葛根由1:1%组成。具有活血化瘀、通脉通络的功效。临床上对中风、脑损伤、动脉硬化、冠状动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化和心绞痛有良好疗效。通脉颗粒组方药物的化学研究及药理研究表明,多酚类成分是心血管药理主要活性成分。以葛根素为代表的异黄酮类是葛根的主要成分,具有多种心血管药理活性LiuCF等研究发现,通脉颗粒的吸收入血成分基本来自葛根的异黄酮类及其代谢物,未见丹参、川芎的药物成分1材料和试剂1.1药品、药品与药品通脉颗粒由河北省神威药业有限公司生产(批号:20100914);丹参素(DSS)、迷迭香酸(RA)、紫草酸(LA)、丹酚酸A(SAA)、阿魏酸(FA)对照品购自天津一方科技有限公司(批号:201004);丹酚酸B(SAB,批号:111562-200807)、柚皮苷(Nar,批号:110722-200610)对照品购自中国食品药品检定研究院;芒柄花素(TM6)、大豆苷元(TMF1)、原儿茶醛(TMF2)、反式阿魏酸(TMF3)、大豆苷(TMF6)、3′-甲氧基葛根素(TMF7)、葛根素(TMF10)、芹糖基葛根素(TMR2)、3′-羟基葛根素(TMR3)对照品由北京大学药学院杨秀伟教授课题组分离提供,纯度均大于98%。质谱分析用甲醇和乙腈均为色谱纯,由德国Merk公司生产。流动相用甲酸为美国J.T.Baker公司生产,其他样品处理用试剂为分析纯由北京化学试剂公司生产。抗坏血酸由国药集团化学试剂有限公司生产。液质分析用水为娃哈哈纯净水,杭州娃哈哈食品公司产品。细胞培养用试剂:高糖DMEM(批号:SH30022.01B,美国Hyclone公司);无糖DMEM(批号:11966,美国GIBCO公司),胎牛血清(批号:16000-044,美国GIBCO公司);胰蛋白酶(批号:27250018,美国GIBCO公司);MTT(批号:298-93-1,美国Amresco公司);DMSO(批号:D-5879,美国Sigma公司)。1.2仪器液相质谱联用仪(API4000QTRAP),配有TurboV1.3动物和细胞的来源2方法2.1动物实验和样本采集健康雄性SD大鼠,适应性饲养1周后,随机分为12组,每组8只。4组空白组大鼠蒸馏水灌胃,4组单次给药组15g·kg2.2血浆样本处理首先将100μL血浆依次加入5μL的盐酸溶液(1mol·L2.3质谱分析条件色谱条件为色谱柱:MerckChromolithRP-18e50×2mm(2μm)整体柱;柱温:10℃;流动相:A为含0.07%甲酸的水,B为乙腈׃甲醇(1׃1),含0.07%甲酸。按照0-0.3min:5%-20%B,0.3-3.3min:20%-55%B,之后维持55%B至4.5min;4.6-8min:5%B的梯度流动相洗脱,流速0.5mL·min质谱分析采用ESI离子源,离子源参数设置为Curtaingas:20psi,Gas1:55psi,Gas2:55psi;Collisiongas(CAD):Medium,温度600℃;离子喷雾电压:-4.5kV。化合物相关参数如表1所示。2.4细胞活力检测H9C2细胞株培养:细胞接种至T25培养瓶,采用高糖DMEM培养液于37℃、5%CO缺氧4h/复氧2h损伤模型的建立:取H9C2细胞悬液,按1悬液、5个/mL的细胞密度接种于96孔板,37℃、5%CO细胞活力MTT检测:细胞复氧结束后,弃培养液,PBS清洗细胞3次,向96孔板中加入MTT溶液100µL/孔,培养箱内孵育4h。吸去MTT液,每孔加入DMSO100µL,将96孔板置于摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解后,在酶标仪490nm波长处检测OD值。给药各组、模型组分别与空白组OD值的比值为各组细胞活力。2.5统计学处理方法所有实验数据用均值±标准差(ue0af±s)表示,采用SPSS16.0统计分析软件进行方差分析,各组间比较用t检验,P<0.05认为有统计学差异。3结果3.1反复给药后血药浓度采用LC-MS/MS方法建立了对8种葛根黄酮成分、5种丹参酚酸成分和2种葛根成分的定量分析方法。方法学考察表明各成分浓度在2.5-500ng·mL从分析结果可以看出,通脉颗粒大部分成分均在5或30min时间点显示最高浓度,反复给药3次后的血药浓度均较单次给药明显升高。所有目标成分均在血浆中检出,但是浓度差别很大。单次给药后浓度较高的6种成分依次是丹参素(DSS)、葛根素(TMF10)、大豆苷元(TMF1)、丹参酚酸A(SAA)、阿魏酸(FA)和3′-甲氧基葛根素(TMF7)。反复给药后前4位的成分与单次给药的结果相同,但是排在之后的则是3′-甲氧基葛根素(TMF7)和3′-羟基葛根素(TMR3)。3.2连续给药对血清培养液细胞活力的影响各组给药血清及空白血清干预H9C2细胞缺氧复氧损伤后测得的细胞活力结果见图2。由图中可知,与空白组相比,模型组细胞活力显著降低;与模型组相比,单次给药30min和60min的血清培养液均能够明显减少细胞损伤;连续给药后所有时间点的血清培养液均能明显减少细胞损伤,且60和120min组细胞活力与空白组接近。实验结果证实通脉颗粒含药血清有效的保护心肌细胞活性。3.3对血清病理活性的影响以各入血成分的血药浓度为自变量,以各相应时间点获得的血清药理活性为因变量进行相关性分析,获得各成分的血清药化-血清药理相关系数见图3。从分析结果可见14种成分与细胞活性正相关,丹酚酸B与细胞活性呈负相关。与保护心肌细胞活性相关度较高的成分是大豆苷元(TMF1)、紫草酸(LA)、丹酚酸A(SAA)、丹参素(DSS)和迷迭香酸(RA)。虽然葛根素具有较高浓度,但是相关性却较低。此外,对所有成分浓度之和(TOTAL)、3种浓度最高成分(T3)及3种最相关成分之和(TP3)与血清药理活性进行相关分析,结果3种分析方式下都获得正相关结果,其中TP3相关系数最高。相关分析获得的相关系数值整体都不够高,最高不超过0.5,只有TMF1的P值小于0.1,这可能与只是采用了比较简单的线性回归分析且样本量较小有关。4血清药化和血清病理研究的初步分析和数据库的建立目前认为活血通脉功效的中药复方对心肌缺血保护作用明显。通脉颗粒具有活血通脉功效必然有其物质基础。本研究采用血清药化与血清药理相结合的方法,以通脉颗粒为研究对象,进一步证实活血功效对缺氧复氧心肌细胞的保护作用,并探讨了活血化瘀中药复方潜在的物质基础。在前期通脉颗粒复方成分较系统的研究中,对其中化学成分有了深入的了解,分离获得了这些成分的标准品,为之后体内成分的定量分析做了有力的支撑中药血清药理学研究方法是以含药血清在体外的药理效应来反映药物在机体内的作用机理,它与含药血清中的药物浓度直接相关本研究室前期多次采用细胞血清药理方法,对多种心血管中药复方及成分进行了研究,建立了比较成熟的血清药理实验方法在获得通脉颗粒血清药化和血清药理数据的基础上,研究尝试了两者之间的相关性分析。结果除丹酚酸B的其他成分多与药效呈正相关,但相关系数差异较大。这体现出不同成分针对某一药效指标具有不同的作用方式和作用强度,例如:所有成分之和及主要成分之和与药效之间的相关性较差。因此,如果以常规的血清中含量高的成分来预测药效,结果必然会与真实情况相差很大。对于PK/PD更为精确的分析,需要构建较大的成分-效应数据库,由于本研究数据量有限,因此只做了初步的相关性分析