蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座

蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第1页食品和其原料中蛋白质含量测定，主要（也是最常见）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包含非蛋白氮，所以只能称为粗蛋白含量（但马铃薯等非蛋白氮多要单测）。蛋白质是生命物质基础，人体11%~13%总热量来自蛋白质。不论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不一样。蛋白质是食品最主要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品色、香、味。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第2页

蛋白质测定方法分两大类：

一类是利用蛋白质共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；

另一类是利用蛋白质中氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。

详细测定方法：凯氏定氮法——最常见，我国外应用普遍。双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法国外：红外分析仪蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第3页氨基酸总量——酸碱滴定法测定。各种氨基酸分离与定量——色谱技术。有各种氨基酸分析仪。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第4页第二节蛋白质定性测定一、蛋白质普通显色反应电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。书中列举了5种染料。二、复合蛋白质显色反应（一）糖蛋白显色（3种方法）（二）脂蛋白显色（2种方法）蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第5页第三节蛋白质定量测定

普通说来，动物性食品蛋白质含量高于植物性食品。比如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉9.5%，兔肉21%，鸡肉20%，牛乳3.5%，带鱼18.0%，大豆40%，面粉9.9%，菠菜2.4%，黄瓜1.0%，苹果1.4%

测定食品中蛋白质含量，对于评价食品营养价值，合理开发利用食品资源、提升产品质量、优化食品配方、指导经济核实及生产过程控制均含有极其主要意义。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第6页一些蛋白质含氮量

普通为15%~17.6%，有上下浮动

能够测出总氮N

一、 凯氏定氮法

由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。书中只介绍前三种。=N×6.25=蛋白质含量蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第7页

（一）常量凯氏定氮法

1.原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。①用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。依据标准酸消耗量能够计算出蛋白质含量。②也能够用过量标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量酸。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第8页

整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定

1.消化总反应式：<1>加硫酸钾作为增温剂，提升溶液沸点，纯硫酸沸点340℃，加入硫酸钾之后能够提升至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用浓硫酸（98%）蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第9页<2>加硫酸铜作为催化剂。还能够作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还能够加氧化汞、汞（都有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。<3>加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第10页仪器：219页要预防爆沸。另外：介绍“自动回流消化仪”蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第11页2.蒸馏

消化液+40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。

蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第12页3.吸收与滴定<1>用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂）国家标准用亚甲基兰+甲基红。指示剂红色绿色红色

（酸）（碱）（酸）<2>用过量H2SO4或HCl标准溶液吸收，再用NaOH标准溶液滴定过剩酸液，用甲基红指示剂。吸收滴定蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第13页

操作方法：158页，其中讲“以奈氏试

剂”检验氨是否全部蒸完，以奈氏试剂——〔Nessler试剂，K2（HgI4）〕

检验NH4+离子，遇铵根，离子析出黄色或红棕色沉淀。配制方法1、3.5gKI+1.3gHgCl2溶于70毫升水。加30毫升4mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第14页

方法2、溶解11.5gHgI2+KI10g于适量少许水，后加水稀释至50ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。

结果计算：158页注意：F——氮换算为蛋白质系数，普通为

6.25也可查表。说明：①所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。②消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上含氮化合物在无硫酸存在情况下消化不完全而造成氮损失。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第15页

③消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，方便利用冷凝酸液将附在瓶壁上固体残渣洗下，并促进其消化完全。

④样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为预防泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少许辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。⑤当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢2—3m1后再继续加热消化。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第16页

⑥若取样量较大，如干试样超出5g可按每克试样5m1百分比增加硫酸用量。

⑦—般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有尤其难以氨化氮化合物样品．如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。⑧蒸馏装置不能漏气。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第17页

⑨蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。

氢氧化铜在70～90℃时发黑。

⑩蒸馏完成后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源．不然可能造成吸收液倒吸。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第18页二、 微量凯氏定氮法1、原理及适用范围同前2、与常量法不一样点：加入硼酸量有50ml10ml,滴定用盐酸浓度由0.1mol/L0.01mol/L,可用微量滴定管。3、蒸馏装置见159页图10-2。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第19页10-210-2蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第20页

三、 自动凯氏定氮法

1、原理及适用范围同前

2、特点：（1）消化装置用优质玻璃制成凯氏消化瓶，红外线加热消化炉。（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完成。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并统计，12分钟完成1个样。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第21页北京福德泰和科技有限企业产品名称：凯氏定氮仪

蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第22页二、双缩脲法传统凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。新开发：双缩脲法、紫外分光光度法、染料结正当、水杨酸比色法等。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第23页1. 原理脲（尿素）NH2—CO—NH2

加热至150~160℃时，两分子缩和成双缩脲。双缩脲能和硫酸铜碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键—CO—NH—与双缩脲结构相同。在一样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3NH2—CO—NH2

+

NH2—CO—NH2蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第24页

注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化

2. 方法特点及应用范围本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常见此法。本法亦适合用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。

3.主要仪器：分光光度计，离心机（4000r/min）

4.试剂：

(1)碱性硫酸铜溶液

(2)四氯化碳蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第25页5．操作方法：采取凯氏法测出蛋白质样品为标准样绘标准曲线。三．紫外吸收法1．原理：利用蛋白质特有基团，│R（—NH—CH—CO）对紫外光有吸收作用在280nm下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第26页2．适用范围：常见于生物化学工作，因为干扰原因多，故在食品分析领域应用不广泛。3．主要仪器：①紫外分光光度计②离心机（3000—5000r/min）4．操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第27页第五节氨基酸定性测定利用各种显色反应（170～174页）。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第28页第六节氨基酸定量测定

一．氨基酸普通定量测定

（一）甲醛滴定法

1.原理：氨基酸本身有碱性—NH2—

基，又有酸性—COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与—NH2—

结合，碱性消失，再用强碱来滴定—COOH基。2．特点：适合用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量降低情况等。（适于食品中游离氨基酸测定）蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第29页3．双指示剂：①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。②0.1%百里酚酞乙醇溶液，③0.1%中性红50%乙醇溶液，④0.1mol/L氢氧化钠标准溶液。4．操作：同时取两份样：①+中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和样液中其它酸性物质。②+百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴，中和了样液中氨基酸羧基与其它酸性物质总和。二者之差可计算氨基酸含量蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第30页（二）茚三酮比色法

原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。二．个别氨基酸定量测定介绍了8种氨基酸定量测定方法。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第31页第七节氨基酸分离与测定

一．薄层色谱法（薄层层析法（TLC法）ThinLayerChromatography介绍：

多年来发展起来一个微量而快速层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用适当溶剂展开，从而到达分离、判定和定量目标。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它应用范围比纸上层析更广泛，常见来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第32页（一）原理：

取一定量经水解样品溶液，滴在制好薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过屡次被吸附、解吸、交换等作用，同一物质含有相同Rf值，不一样成份则有不一样Rf值，因而各种混合物可到达彼此被分离目标。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，判别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色深浅能够大致确定其含量。

蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第33页Rf=a/bab样点溶剂前沿点样原点蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第34页优点：①展开时间短，普通在20—30分钟，展开距离通常只需10cm，且分离效果好。②层析后得到斑点小而清楚。③能够使用各种显色剂。④点样量少，灵敏度高。（比纸层析高10—100倍）准确到0.01ug。⑤也可用于大量分离＞500mg，作为样品制备层析。缺点：Rf值重现性比纸上层析差。分类：按层析原理可分为：吸附、分配、离子交换、凝胶等。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第35页（三）操作方法：①薄层板制备②样品液制备③点样：距薄板底端2cm处，用针画一标识作为原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时展开，点与点之间间隔1～2cm。a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注意要等一个点干了再点另一个点。b.用一小直径ф3mm滤纸片，浸入样液，埋到板子上先挖好一个小洞穴。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第36页④展开：点样完了，放入密闭容器中（展开槽），倾斜一定角度10～30°，下端浸入展开剂1cm，千万别让溶剂浸过了样点。到离顶端一个别，取出样板、晾干、显色。a.展开剂相关情况：主要是低沸点2～3种有机溶剂组成溶剂系统，分离效果主要决定于展开剂选择，因为吸附剂在一定情况下是恒定，吸附剂选择余地远远小于展开剂选择。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第37页b.展开剂选择方法：Ⅰ.微量圆环法。Ⅱ.用小载波片试验，微量展开剂展开5cm。Ⅲ.图解法：样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低。样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。有机溶剂极性由小到大为：石油醚、环己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有机酸类等。蛋白质和氨基酸的测定专题知识讲座第38页c.展开方式：上行法、下行法、双向展开、单向屡次展开、双向屡次展开。双向展开：蛋白质和氨基酸的测