稻虾共作模式稻田反硝化微生物群落结构的影响因素

稻虾共作模式稻田反硝化微生物群落结构的影响因素

反硝化作用是在低氧或厌氧条件下，通过反硝化细菌中的亚硝酸盐或亚硝酸盐作为电子受体，并将其转化为氨氮信息。大量研究表明,nirK型反硝化细菌存在于农田、森林、草地、沉积物及水体等环境中本文利用IlluminaMiseq高通量测序技术对稻虾共作模式稻田土壤中nirK反硝化细菌的群落结构及多样性进行分析,并通过冗余分析(RDA)来探索影响nirK反硝化细菌的关键因子,以期揭示稻虾共作模式土壤反硝化细菌的多样性及群落结构的变化,为深入认识该种植模式下反硝化作用微生物调控机制提供理论依据。1材料和方法1.1稻虾共作模式mr试验地位于湖北省荆州市长江大学试验基地(30°6′N,111°54′E),属江汉平原渍涝农田区域。该地区属亚热带季风气候,为冲积性母质发育的水稻土,年平均气温约16.4℃,全年≥0℃积温6228.4℃,无霜期250d,年均降雨量1148mm,年均日照时数2000h,年太阳辐射总值约470Juf0d7cm试验设置稻虾共作模式(CR)和常规中稻模式(MR)两个处理,各处理分别设置3个小区,随机区组设计,小区面积为60m稻虾共作模式稻田从2014年由常规中稻稻田改成。水稻移栽3d后放养虾苗,供试品种为‘克氏原鳌虾’,投放密度为15.01uf07e22.50万只uf0d7hm1.2样品采集和保存于2016年水稻抽穗期(8月6日,田间水层高度2~5cm)取稻田表层(0uf07e10cm)土壤,采用五点取样法,采样点距离周围植株5~10cm,各小区采集5份土样均匀混合成1个样品,除去根系、碎石及其他杂物后分为两部分。一部分迅速用灭菌锡箔纸包裹,放入液氮罐中低温保存,带回实验室后放入超低温冰箱,-80℃保存,用于微生物研究;另一部分鲜土采用自封袋密封后带回实验室放入冰箱,-4℃保存,测定铵态氮和硝态氮,该部分剩余土风干后过100目筛测定土壤pH、碱解氮、全碳和全氮含量。1.3测定土壤pH采用电位法(水∶土=2.5∶1)测定;土壤全碳、全氮均使用元素分析仪(ECS4024,Costech,Italy)测定1.4dna提取及pcr扩增取0.25g新鲜土壤样品,采用PowerSoil选用引物nirK1aCu(5uf0a2-ATCATGGTSCTGCCG-CG-3uf0a2)和nirKR3Cu(5uf0a2-GCCTCGATCAGRTTGTGG-TT-3uf0a2)扩增nirK基因将PCR产物回收,连接至pUC-T载体(CWBIO,北京,中国)上,转化大肠埃希菌DH5uf061后进行培养,选择阳性克隆菌株提取质粒,采用核酸检测仪检测浓度和纯度,将浓度换算成拷贝数,梯度稀释,-80℃保存,用于制备标准曲线。1.5illmumicamiseq测序参照电泳初步定量结果,将PCR产物用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量,之后按照每个样本的测序量要求,进行相应比例的混合,然后用IllmuminaMiseq测序平台进行双末端测序,测序服务委托北京美吉桑格生物医药科技有限公司完成。MiSeq测序得到的是双端序列数据,使用FLASH和Trimmomatic软件首先根据PEreads之间的overlap关系,将成对的reads拼接(merge)成1条序列,同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤,根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列,并校正序列方向,即为优化数据,数据去杂方法和具体参数设置依据杨亚东等1.6生物多样性分析使用Usearch7.1软件将优质序列聚类成操作分类单元(OperationalTaxonomicUnits,OTU),按照97%相似性对重复序列(不含单序列)进行OTU聚类,采用RDPclassifier分类法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析;使用Mothur1.30.1软件在相似水平97%上进行微生物多样性指数评估。数据方差分析和相关性分析用SPSS20.0软件完成,采用单因素方差分析法区分样品间的显著性差异(n=3,Tukey,P<0.05);利用R语言工具制作曲线图及Pearson热图,利用CANOCO5.0软件对土壤理化性质和nirK基因反硝化群落结构进行冗余分析(RDA)。2结果与分析2.1铵态氮、土壤理化指标在0~10cm土层土壤中,稻虾共作模式(CR)土壤硝态氮、全碳、全氮含量均显著高于常规中稻模式(MR)(P<0.05)(表1)。pHCR低于MR,差异不显著(7.41~7.47,P>0.05);碱解氮和铵态氮含量CR均高于MR,差异不显著(P>0.05);碳氮比CR低于MR,差异不显著。研究结果表明,稻虾共作模式可显著提高水稻抽穗期稻田土壤中硝态氮、全氮及全碳的含量,对碳氮比和碱解氮、铵态氮含量没有显著影响。2.2土壤多样性指数分析采用Miseqsequencing技术对微生物nirK基因测序分析,数据经过优化筛选后6个样品共测得原始序列209777条,序列平均长度为448.16bp,共测得碱基94009020个,所有样品的序列长度在202~537bp(表2)。按97%的相似度对非重复序列进行OTU分析,共得到344个OTUs。对各样本序列进行随机抽样的方法,以抽到的序列数与它们对应的物种多样性指数,构建稀释曲线(rarefactioncurves)。样本Coverage指数在0.9966~0.9978,稀释性曲线均趋于平坦饱和,表明此测序深度获得序列数据量可以反映土壤样品nirK基因微生物信息(图1)。对Alpha多样性指数进行单因素方差分析(表3),结果显示两处理间Shannon指数和Simpson指数差异不显著,CR处理的Sobs指数、Ace指数和Chao指数均显著高于MR处理。Sobs指数、Ace指数、Chao指数是衡量微生物群落丰富度指数,Shannon指数和Simpson指数是衡量微生物群落多样性的重要指标。结果表明,稻虾共作模式(CR)较常规中稻模式(MR)显著增加了稻田土壤nirK基因微生物的群落丰富度,未显著改变nirK基因微生物群落的多样性。2.3cr、盐杆菌属的比较表3在水稻抽穗期,对CR处理和MR处理nirK基因微生物进行目、科、属、种的物种分类学水平分析(图2)。在目水平上,CR处理和MR处理具有相同的10个目(图2a),MR处理独有红螺菌目(Rhodospirillales)。在科水平上,CR处理和MR处理具有相同的15个科(图2b),MR处理独有红螺菌科(Rhodospirillaceae)。在属水平上,CR处理和MR处理具有相同的23个属(图2c),MR处理独有2个属,分别是红螺菌目红螺菌科的固氮螺菌属(Azospirillum)和根瘤菌目根瘤菌科的中华根瘤菌属(Sinorhizobium),CR处理独有盐杆菌目盐杆菌科的盐惰菌属(Halopiger)。在种水平上,CR处理和MR处理具有相同的35个种(图2d),MR独有8个种,分别是红假单胞菌属的Rhodopseudomonas_sp._2-8、Rhodopseudomonas_palustris,中华根瘤菌属的Sinorhizobium_sp._R-24605,根瘤菌属的Rhizobium_sp._R-24658,包西氏菌属的Bosea_sp._MF18,中慢生根瘤菌属的Mesorhizobium_sp._D237c,norank_p__environmental_samples_k__norank属的uncultured_marine_bacterium,固氮螺菌属的Azospirillum_sp._TSH20;CR独有2个种,分别是norank_p__environmental_samples_k__norank属的uncultured_bacterium_d__Archaea和盐惰菌属的Halopiger_xanaduensis。分析表明,稻虾共作模式改变了常规稻田模式的nirK基因微生物在目、科、属、种水平的群落组成,较常规中稻模式,稻虾共作模式在各分类水平组成类群均减少。2.4cr、mr算法处理优势目的比较两处理所有土壤样品获得的nirK基因微生物物种分类在3个界、5个门、7个纲、11个目、16个科、26个属和45个种。将无法分类的序列定义为无法归类。两处理所有样品获得的nirK基因OTUs在分类学界、门、纲、目、科、属、种水平上可归类比例为97.8%、96.0%、93.0%、89.0%、84.4%、73.3%和60.0%。在目水平上,Rhizobiales(根瘤菌目)、unclassified_k__norank_d__Bacteria、unclassified_d__Unclassified、unclassified_p__Proteobacteria和norank_p__environmental_samples_k__norank为两处理平均相对丰度同时大于1%的5个优势目(图3),CR处理3次重复平均相对丰度分别为47.0%、40.5%、6.9%、2.0%和3.0%,MR处理3次重复平均相对丰度分别为59.4%、31.7%、3.3%、3.2%和2.0%,两处理中的优势目平均相对丰度差异没有达到显著水平(P(29)0.05)。Burkholderiales(伯克氏菌目)、Rhodospirillales(红螺菌目)、unclassified_c__Betaproteobacteria为MR处理平均相对丰度介于0.01%~1%的目,平均相对丰度分别为0.18%、0.07%、0.06%,在CR处理中平均相对丰度分别为0.19%、0、0.35%,其中Burkholderiales和unclassified_c__Betaproteobacteria在两处理中相对丰度没有达到显著性差异,CR处理缺失Rhodospirillales(红螺菌目)。两处理共有目的相对丰度差异不显著,稻虾共作模式较常规中稻模式改变了目的种类,对共有目相对丰度没有显著性改变。2.5植物群落分析结果对97%相似水平的OTU代表序列进行DCA分析,如果Lengthsofgradient第1轴的值大于4.0,选CCA分析;如果介于3.0~4.0,选RDA和CCA分析均可;如果小于3.0,RDA分析优于CCA分析。分析结果中Lengthsofgradient第1轴的大小为0.906,选用RDA分析环境因子、样本、菌群三者间的关系。RDA分析的前两个排序轴共解释了91.65%的群落变化(图4),第1排序轴(RDA1)解释了81.04%,第2排序轴(RDA2)解释了10.61%。第1排序轴与土壤总碳(TC)、铵态氮(NH3稻虾共作模式对盐杆菌目和根瘤菌目的功能影响Delmont等稻虾共作模式与常规中稻模式的微生物群落结构组成在目、科、属、种水平上存在差异。相比MR处理,稻虾共作模式缺失红螺菌目、红螺菌科、Azospirillum(固氮螺菌属)及根瘤菌目根瘤菌科的Sinorhizobium(中华根瘤菌属),稻虾共作模式增加盐杆菌目盐杆菌科的Halopiger(盐惰菌属)。稻虾共作模式缺失的红螺菌目和根瘤菌目均具有固氮和固碳的功能环境因子与反硝化细菌群落的冗余分析(RDA)发现硝态氮含量是影响nirK反硝化细菌群落结构的主效因子。Xie等4对稻田土壤nirk基因物种目水平及群落结构的影响与常规中稻模式相比,连续3年稻虾共作模