溴氰菊酯对克氏原螯虾肌肉组织超微结构损伤的影响

溴氰菊酯对克氏原螯虾肌肉组织超微结构损伤的影响

克氏原始虾（proembolni）通常被称为小龙虾，具有清新、美丽、高营养价值等特点。在中国，该市有着非常受欢迎的市场。这是中国淡水养殖的著名品种之一。正因如此,克氏原螯虾的健康养殖也倍受重视。稻虾共生是一种较为常见的养殖模式,经多年的发展,目前已成为克氏原螯虾主要养殖方式之一。调查表明,因菊酯类农药(Pyrethroids)对防治多种水稻害虫效果明显,目前该类农药在水稻生长过程中使用较为普遍。然而,菊酯类农药对水生动物毒性极强,水田用药后,药物不可避免地会进入水环境中,对养殖的鱼类、虾蟹类产生严重的毒害迄今为止,关于菊酯类农药对水生动物的毒性效应报道多集中在对鱼类的研究中甲壳动物的肌肉组织是机体运动功能的效应器官,也是能量代谢的主要部位。肌细胞结构的完整性,代谢功能的正常,以及肌肉的神经支配功能正常是机体行使正常运动功能的三个保证,其中任何一个环节出现障碍都会导致肌肉疾病的产生,从而影响机体的运动功能肌细胞中富含的线粒体是产生ATP的主要部位,细胞色素氧化酶(cytochromeCoxidase,CCO)是线粒体内膜电子传递链的最后一个环节,是有氧呼吸的关键酶,也是线粒体内膜的标志酶。在无氧情况下,丙酮酸不进入线粒体,在胞质中被乳酸脱氢酶(lacticdehydrogenase,LDH)催化生成乳酸(lacticacid,LD)。这些酶的活性可以很好地反映细胞的呼吸情况,从而反映细胞能量产生情况本实验拟研究溴氰菊酯对克氏原螯虾肌肉的毒性,首先观察肌肉超微结构;其次,以CCO活力、LDH活力以及乳酸含量为指标,研究不同浓度的溴氰菊酯对肌肉收缩过程中能量供应过程的影响。1材料和方法1.1实验用虾及其水质实验用克氏原螯虾由上海滩涂生物资源开发研究所所属养殖基地(崇明)提供,在300L的水箱中暂养一周,每天定时定量投喂野生小杂鱼,24h换水1/2;暂养期间持续充氧,实验前24h暂停投喂。挑选附肢齐全、健康活泼、规格统一的虾作为试验用虾,平均体长(8.20±0.28)cm,平均体质量(19.44±2.00)g。实验用水为充分曝气的自来水,pH为8.61±0.04,溶解氧DO为(7.30±0.16)mg/L,水温为(23.29±0.05)℃。正式实验在玻璃养殖缸内进行,每个药物处理组设2个平行实验组,每缸随机放入10只实验虾。1.2试剂与仪器溴氰菊酯原药(纯度98%),原产地印度,购于上海永远化工有限公司;乳化剂(农乳2201),购于江苏钟山化工有限公司;溶剂二甲苯(分析纯),冰醋酸(分析纯),无水乙醇(分析纯)均购于上海国药集团。2.5%(m/v)的溴氰菊酯母液配制试剂LDH、LD和考马斯亮蓝总蛋白试剂盒,均购于南京建成生物工程研究所。CCO试剂盒购于上海杰美科技有限公司。仪器透射电镜JEOLJEM-1230;紫外可见分光光度计(普析通用T6-新世纪);冷冻离心机(eppendorf5417-R);台式离心机(湘仪L500);电热恒温水浴锅(上海精宏DK-S26);电子天平(上皿FA2104);移液枪(eppendorf);玻璃组织匀浆器(高信化玻);便携式溶氧测定仪(雷磁JPB607);微机防水笔型pH计(上海理达PHSCAN/30)。1.3组织匀浆的制备暴露浓度的确定根据毒性实验结果肌肉组织的匀浆随机分组后,每次每缸取克氏原螯虾5只,快速采取肌肉组织,用0.86%预冷生理盐水制备成10%的组织匀浆。匀浆过程在冰浴条件下进行。肌肉组织CCO活力、LDH活力、LD和总蛋白含量的测定实验方法及步骤参照试剂盒使用说明书。每个样本重复测定2次。肌肉的采取和电镜样品的制备在既定的取样时间点,迅速采取克氏原螯虾的肌肉组织,用锋利的双面刀片切成约1mm1.4统计学处理方法使用EXCEL2007和SPSS17.0统计软件对数据进行处理,组间差异显著性使用单因素方差分析的SNK、Dunnett法以及t检验法进行检验。2结果2.1肌原纤维断裂及损伤情况对照组的肌原纤维排列整齐,肌浆网丰富,M线清晰可见,线粒体丰富且结构完整(图版-1,2)。溴氰菊酯暴露6h后,处理组的肌细胞超微结构可观察到明显的损伤,0.005μg/L浓度组肌细胞内肌原纤维断裂,大量肌浆网溶解,线粒体结构损伤明显,双层膜结构被破坏,内嵴溶解(图版-3,4);相同处理时间0.1μg/L浓度组观察到了类似的损伤情况,肌原纤维混乱,线粒体外膜溶解,内嵴溶解(图版-5,6)。溴氰菊酯暴露12h后,0.1μg/L浓度组的损伤程度加深,肌纤维结构混乱,细胞结构空泡化,线粒体溶解(图版-7,8)。高浓度组0.5μg/L溴氰菊酯处理1h后,由每个肌节的明带和暗带范围可以看出肌肉处于收缩状态,肌纤维断裂,肌浆网溶解,线粒体结构破裂,内部物质溶解(图版-9,10)。2.2和24h组对照组不同处理时间CCO值无显著差异(P>0.05),组间平均值为(32.99±1.45)U/mgprot。0.005μg/L的溴氰菊酯暴露处理过程中,不同处理时间CCO值与对照组相比有明显的下降。1和3h时的CCO值与对照组相比下降了24.08%和15.88%,但是差异不显著(P>0.05);6、12和24h时的CCO值与对照组相比分别下降了46.94%、51.68%和55.04%,差异显著(P<0.05)(图1)。该结果说明,0.005μg/L的溴氰菊酯在6~24h的暴露处理过程中对肌肉的CCO活力产生了显著的抑制作用。0.1μg/L的溴氰菊酯暴露处理过程中,不同处理时间CCO值与对照组相比很明显的下降。1和3h时的CCO值与对照组相比下降了36.98%和36.02%,但是差异不显著(P>0.05);而6和12h时的CCO值均为0(P<0.01);24h时的CCO值比对照组下降了75.65%,差异极显著(P<0.01)。该结果说明,0.1μg/L的溴氰菊酯在6~24h的暴露处理过程中会对肌肉的CCO活力产生极显著的抑制作用。0.5μg/L的溴氰菊酯暴露1h后,CCO值也接近0(P<0.01)。该结果说明,0.5μg/L的溴氰菊酯暴露处理1h即会对肌肉CCO活力产生极显著的抑制作用。2.3两组ldh值比较对照组不同处理时间LDH值无显著差异(P>0.05),组间平均值为(2989.50±87.80)U/mgprot。0.005μg/L的溴氰菊酯暴露处理过程中,3和6h时的LDH值与对照组相比上升了18.97%和23.68%,差异显著(P<0.05);而1、12和24h时的LDH值与对照组相比差异不显著(P>0.05)(图2)。结果表明,0.005μg/L的溴氰菊酯在3和6h的暴露处理过程中会导致肌肉的LDH活力显著增强。0.1μg/L的溴氰菊酯暴露处理过程中,1h时的LDH值为(3479.80±127.27)U/mgprot,与对照组相比上升了20.76%,但是差异不显著(P>0.05);3~12h时的LDH值比对照组上升了19.05%、22.85%和17.65%,差异显著(P<0.05);24h时的LDH值与对照组相比仍保持升高状态,但是差异不显著(P>0.05)。结果表明,0.1μg/L的溴氰菊酯在24h的暴露处理过程中,会导致LDH活力增强。0.5μg/L的溴氰菊酯暴露1h后,LDH值为(3758.33±540.97)U/mgprot,与对照组相比,上升了30.42%,差异显著(P<0.05)。结果表明,0.5μg/L的溴氰菊酯暴露处理1h即会导致肌肉LDH活力显著增强。2.4两组ld含量的比较对照组不同处理时间LD含量无显著差异(P>0.05),组间平均值为(0.57±0.024)mmol/gprot。0.005μg/L的溴氰菊酯暴露处理过程中,1~12h时的LD含量都高于对照组,其中3和6h时的LD含量分别比对照组上升了41.01%和40.71%,差异显著(P<0.05);24h的LD含量恢复至对照组水平(P>0.05)(图3)。结果表明,0.005μg/L的溴氰菊酯在3和6h会导致肌肉中的LD含量显著上升。0.1μg/L的溴氰菊酯暴露处理过程中,不同处理时间LD含量均高于对照组。3、6、12和24h的LD含量分别比对照组上升了52.94%(P<0.05)、81.94%(P<0.01)、92.69%(P<0.01)和89.28%(P<0.01)。结果表明,当溴氰菊酯浓度提高到0.1μg/L水平时,LD含量在24h内会显著高于正常水平。0.5μg/L的溴氰菊酯暴露1h后,肌肉中的LD含量比对照组上升了77.21%,差异极显著(P<0.01)。该结果说明,在肌肉中,0.5μg/L的溴氰菊酯在1h内会导致LD含量极显著上升。3虾类致毒药物的研究菊酯类物质对鱼、虾、贝类等水生动物的毒性极强。相比较鱼类,虾类对菊酯类农药显得更为敏感,而迄今为止菊酯类农药对虾类致毒机理的研究课题尚未引起研究者的广泛关注,相关的研究报道并不多见。魏华等3.1理论推导的安全浓度组织病理学检查有助于研究水体污染物质、农药、病源微生物、病毒等对水生动物的致毒机理,能够直观且可靠地反映水生动物中毒或感染后各种组织的损伤情况值得注意的是,安全浓度0.005μg/L处理组也观察到了类似的肌细胞结构损伤,该结果表明,理论推导的安全浓度对克氏原螯虾而言并不一定是绝对安全浓度,对细胞仍然会产生毒性,只是不会引起能够观察到的死亡或行为异常现象。张婷另外,急性毒性实验0.5μg/L暴露1~2h内,克氏原螯虾反应强烈,会突然弓背且持续抽搐,虾体向后弹跳,继而侧卧,最后会在2h内僵硬死亡。超微结构观察表明,0.5μg/L溴氰菊酯能够在1h内对克氏原螯虾肌细胞结构产生严重损伤,肌纤维的明暗带结构可以看出肌肉处于急剧收缩状态。该结果与急性中毒症状吻合,推测此时克氏原螯虾对药物反应处于应激状态。综上所述,溴氰菊酯对克氏原螯虾肌肉组织毒性明显,且与暴露浓度和时间呈正相关。该结果提示,肌肉组织超微结构受损可能是克氏原螯虾中毒后运动功能障碍的直接原因。而线粒体结构的损伤则提示了溴氰菊酯可能会对肌细胞能量代谢过程产生影响。3.2溴氰菊酯对肌细胞的影响CCO是线粒体内膜上的标志酶,也是有氧呼吸的关键酶。线粒体结构的损伤将会对细胞的有氧呼吸作用产生影响,进而影响细胞的能量代谢过程。本研究表明,0.1μg/L的溴氰菊酯暴露处理6和12h时,CCO活力已经无法被检测到,与对照组相比差异极显著(P<0.01),说明此时肌肉细胞的有氧呼吸功能已经受到了严重的阻碍;24h时虽然CCO活力有所回升,但仍然极显著低于对照组(P<0.01);而LDH活力显著增强(P<0.05),LD含量相应地升高(P<0.01),说明0.1μg/L的溴氰菊酯暴露处理24h过程中,肌细胞的无氧呼吸受到了激发,有氧呼吸受到抑制。分析原因可能是由于0.1μg/L溴氰菊酯暴露6h后,肌细胞内线粒体的结构被破坏,线粒体内膜上的CCO酶构象也遭到破坏,故无法检测到其活性。在继续暴露至24h的过程中,LDH活性持续上升(P<0.05),肌细胞以无氧呼吸为主,通过无氧呼吸产生的少量能量维持细胞的基本生存需要,这也是在药物持续刺激下机体维持生存和自我修复的方式。而在药物持续暴露过程中无氧呼吸产生的大量乳酸(P<0.01),又会对细胞产生毒性,故在24h时,肌细胞经过一段时间的自我修复后CCO活力虽然有所回升,但仍然显著低于对照组(P<0.