lamp法检测克氏原螯虾白斑综合征病毒的研究

lamp法检测克氏原螯虾白斑综合征病毒的研究

对照组波形病毒（wssv）是线头病毒科（nimavirius）的唯一成员。目前对WSSV的诊断方法主要包括病理学观察、流式细胞术方法、免疫学方法、生物学方法以及PCR方法等1材料和方法1.1感染虾的来源自然感染WSSV的克氏原螯虾取自江苏省南京市的一个暴发白斑综合征的虾养殖场,由江苏省水生动物疫病预防控制中心提供。1.2两种反应条件的优化1.2.1在检测过程中使用的dns模型的制备本研究使用的方法是根据Kono的热提取法1.2.2引物的合成根据已公布的WSSVORF131序列(GenBank登录号:EF524223)合成引物。4条引物分别为:(1)FIP。包括F1.3巢式pcr检测wssv法根据WSSVORF234(GenBank登录号:AF332093)序列设计,用于检测WSSV巢式PCR的2对引物分别是2个外引物P1.4lamp与巢式pcr检测wssv灵敏度的比较通过快速煮沸法,用感染WSSV的病虾组织制备DNA样品,按照10倍梯度稀释后分别作为LAMP和巢式PCR的模板,进行扩增反应,其结果分别用2%和1%琼脂糖凝胶电泳进行比较,以确定两者检测WSSV的灵敏度差异。2结果与分析2.1lamp反应条件的优化分别用快速煮沸法和苯酚/氯仿法制备的检测样品作为模板,在60、63、65℃环境下进行LAMP反应,其结果经2%琼脂糖凝胶电泳显示效果见图2。当反应温度为65℃时,无论是用快速煮沸法还是用苯酚/氯仿法制备的模板,均没有检测到LAMP的扩增条带;而在63℃反应条件下,两者均可扩增出清晰的条带;当反应温度为60℃时,用快速煮沸法制备的样品进行LAMP也可以获得非常满意的结果,用苯酚/氯仿法制备的样品经扩增后可以出现阳性结果,但扩增效果有明显差异。总体上说,63℃是该反应的最佳温度,用快速煮沸法制备模板的LAMP效果优于用苯酚/氯仿法制备模板。用快速煮沸法制备的DNA检测样品作为模板,进一步考察在63℃条件下反应时间对LAMP的影响。由图3可知,反应时间为30min时没有可供分辨的条带产生,当反应时间延长为45min时开始有较清晰的条带出现,并随着反应时间的延长,其LAMP产物也相应增加,当反应时间延长到75min时效果最好,其后时间再进一步延长对LAMP扩增没有促进作用;阴性对照组经90min反应,并没有观察到条带产生。此外,同样通过快速煮沸法,用病虾组织制备的DNA模板进行LAMP反应来评估甜菜碱在本反应中的影响。在反应体系中分别加入初始浓度为10mol/L的甜菜碱1.25、2.5、3.75μL时,LAMP反应的电泳条带都不够清晰或检测不到。相反,当反应体系中不添加甜菜碱时,其LAMP可扩增出非常清晰的条带。结果发现,优化后检测WSSVORF131的LAMP反应条件是63℃孵育75min,并且反应体系中不须添加甜菜碱(图4)。2.2lamp与巢式pcr检测极限的比较用LAMP检测WSSV的反应时间在45min后即可获得可分辨的条带,所以在比较试验中,LAMP的反应时间确定为45min。将通过快速煮沸法从病虾组织中制备总DNA检测样品,按照10倍梯度稀释后作为模板,分别进行LAMP和巢式PCR反应。琼脂糖凝胶电泳显示,分别用稀释了103lamp反应条件的优化用PCR方法检测WSSV技术成熟,具有一定的灵敏度,但是存在需要专业PCR仪、反应时间较长等缺点,因而在一定程度上限制了它在实际检测中的应用。LAMP法操作简单,无需专业PCR仪,检测灵敏度高,试验耗时短,只要1h左右即可完成扩增反应在制备用于供检测用的核酸模板时,其方法在简繁间差距甚大。有先将WSSV病毒从病虾组织中完全纯化出来,再提取DNA用于LAMP进行扩增,可以得到满意的结果很多LAMP反应的时间都被优化为1h左右。Kono等提出,在检测日本对虾中WSSV的LAMP优化反应条件为65℃、1h,反应45min后会有很好的扩增效果考虑到甜菜碱曾被报道可以通过帮助DNA发生构象变化促进DNA与酶的结合而有利于扩增反应的进行白斑综合征是以感染虾在甲壳内侧出现白色斑点为主要特征,所以主要通过观察虾体是否出现白斑、行动是否变得迟缓等明显患病症状来初步判断虾是否感染了WSSV。但是仅依靠出现白色斑点和虾的行动来诊断容易出现误诊或是对早期感染而不出现白斑症状的病虾无从鉴定。本研究简化了用于检测的DNA模板制备步骤,经优化后的LAMP反应具高灵敏性、特异性、检测时间短等特点。而用该方法可以快