高效液相色谱法检测食用油中多环芳烃

高效液相色谱法检测食用油中多环芳烃

多环芳烃（pahs）是环境中最危险的化学污染物之一，具有癌、遗传毒性和环境毒性。食用油是我国居民烹调饮食的重要组成部分，有关多环芳烃在食用油中的报道较多，污染主要来源于原料、加工过程以及生产工艺，食物在烹调加工过程中也容易产生多环芳烃，因此食用油中多环芳烃污染越来越受到重视。为了降低多环芳烃对人类的危害，各国政府制定食用油中多环芳烃的限量标准。我国GB2762-2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》食用油中多环芳烃的检测技术主要采用高效液相色谱法1材料和方法1.1油、树、料，测定总色谱物质47种植物油样品，包括大豆油(4)、玉米油(3)、花生油(9)、葵花籽油(3)、菜籽油(17)、油茶籽油(6)、米糠油(1)、亚麻籽油(2)、红花籽油(1)、橄榄油(1)，采购于本地超市。标准物质：GBW10162橄榄油中苯并[a]芘等四种多环芳烃成分分析标准物质，中国计量科学研究院。16种多环芳烃标准溶液，200µg/mL，美国o2si公司；二氯甲烷，农残级，北京百灵威科技有限公司；正己烷，色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司；乙腈，色谱纯，默克公司；MIP-PAHs固相萃取柱，500mg/6mL，上海安谱实验科技股份有限公司；AthenaPAHs多环芳烃专用液相色谱柱，4.6mm×250mm，5µm，上海安谱实验科技股份有限公司。1.2股份、液相色谱仪FotectorPlus-60高通量全自动固相萃取仪，睿科集团股份有限公司；AutoEVA-60全自动氮吹浓缩仪，睿科集团股份有限公司；1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；WH-866漩涡混合器，华利达实验设备有限公司。1.3所需国所需国所需国均正己烷清洗干称取0.5g植物油样品至15mL的玻璃管中，加入3mL正己烷溶解混匀，所需器具事先均经过正己烷清洗晾干。将玻璃管按顺序置于自动固相萃取仪的15mL上样架中，运行已编辑好的自动固相萃取方法自动净化，完成后将洗脱液转移至全自动氮吹仪35℃吹至近干，1mL乙腈定容，超声10min，过膜后上机检测。1.4梯度洗脱条件1260高效液相色谱仪配荧光检测器，采用梯度洗脱：流动相A：水，流动相B：乙腈，流速1.2mL/min，进样量20µL，柱温30℃，梯度洗脱条件见表1。全自动固相萃取仪萃取步骤见表2。2结果与讨论2.1多环芳烃种类环境及使用容器耗材中容易存在着萘、苊、芴、菲等，由于轻质多环芳烃不稳定、易挥发，而且在实验中发现，随着淋洗溶剂正己烷洗脱量的增多，轻质多环芳烃逐渐从固相萃取柱洗脱，导致回收率越来越低，故本研究将荧蒽、芘、苯并[a]蒽、䓛、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝和茚并[1,2,3-c,d]芘10种多环芳烃作为研究对象。2.2洗脱溶剂考察不同类型溶剂对食用油中多环芳烃组分的洗脱效率有区别，本研究选择乙酸乙酯、丙酮、丙酮:乙酸乙酯（V/V1:1）及二氯甲烷对洗脱溶剂考察。通过图1可见，使用二氯甲烷作为淋洗溶剂，多环芳烃的回收率73.3%~85.1%，乙酸乙酯50.7%~63.8%，丙酮25.6%~68.5%，丙酮:乙酸乙酯（V/V1:1）48.6%~59.6%，由此可见，二氯甲烷相对于其他溶剂回收率更好。2.3淋洗体积的确定食用油主要组成是甘油三酯，通过淋洗可以洗脱去大部分的油脂，避免杂质等对多环芳烃组分产生干扰。本实验选用正己烷作为淋洗剂，通过将0、1、2、3、4、5、6、7、8mL体积的正己烷淋洗，10种多环芳烃回收率见图2，由图可见，2mL和3mL正己烷淋洗，回收率分别为83.0%~99.0%和84.4%~94.0%，3mL~8mL随着淋洗体积的增大，荧蒽和芘回收率越来越低，重质多环芳烃回收率无较大变化，本实验选择2ml淋洗体积。2.4全自动固相萃取仪的优化本实验参照国家标准GB5009.265-2021《食品安全国家标准食品中多环芳烃的测定》全自动固相萃取仪的步骤设置见表1，更换多种口径和厚度的密封圈，增强柱塞杆的密封性。通过多次实验优化柱塞杆下探深度、上样及淋洗体积、洗脱速率等，提高不同孔间固相萃取柱处理的一致性和重复性。2.5方法验证2.5.1检出限和定量限10种多环芳烃的线性关系、相关系数、检出限及定量限见表3，由表可见，0.1~25.0µg/mL的范围内，线性关系良好，相关系数均大于0.999，以3倍和10倍信噪比（S/N）分别计算检出限和定量限，检出限0.1~1.3µg/kg，定量限0.3~4.0µg/kg。本方法灵敏度高，可以满足日常的检测需求。2.5.2准确度和精度2.5.2.标准物质的测定采购中国计量院研制的GBW10162橄榄油中苯并[a]芘等四种多环芳烃成分分析标准物质，按照“1.3样品处理”，四种多环芳烃的检测结果及标准物质标准值和不确定度（标准物质证书），见下表4，检测结果均在证书不确定度范围之内。2.5.2.加标回收及方法取玉米油和花生油空白样品用于加标回收率的测定，分别在低、中、高3个浓度水平加入多环芳烃标准混合溶液，每个加标水平做5次平行测定，添加回收率及相对标准偏差见表5和表6，10种多环芳烃在玉米油和花生油的加标回收率分别为80.8%~94.1%和79.2%~114.3%，相对标准偏差分别为0.4%~5.7%和0.4%~5.3%。2.5.3油脂及制品超标率利用建立的全自动固相萃取仪高效液相色谱法对市售47种食用油样品进行检测分析，见表7，从实际样品的检测上看，47种食用油样品苯并[a]芘含量均有检出，未超过GB2762-2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》规定的油脂及其制品10µg/kg的限量。但按照欧盟(EC)No1881/2006对苯并[a]芘和PAH4的限量规定，统计47种食用油苯并[a]芘超标率为23.4%，PAH4超标率为21.3%。按食用油种类统计，9种花生油中苯并[a]芘和PAH4超标率均为33.3%，17种菜籽油中苯并[a]芘和PAH4超标率为23.5%和17.6%，3种葵花籽油中苯并[a]芘和PAH4总量超标率均为100%，大豆油、玉米油、亚麻籽油、橄榄油及红花籽油均未超标，花生油、菜籽油、葵花籽油均有污染，且超标较为严重。3实际样品的测定本研究基于分子印迹的原理，通过自动固相萃取仪和高效液相色谱仪，建立食用油中10种多环芳烃的检测方法，减少了有机溶剂的消耗和使用，相对于国标液液萃取后再过柱的方法，本方法前处理自动化程度更高，能满足高通量的检测要求。本方法的加标回收率79.2%~114.3%，相对标准偏差0.4%~5.7%，方法准确度高，精密度好。通过对市场上采购的47种食用油实际样品的检测，苯并[a]芘全部有检出，但均低于国家标准中规定的限量水平10µg/kg。按照欧盟对多环芳烃的限量规定，苯并[a]芘总体超标率为23.4%，PAH4总体超标率为21.3%，污染情况较为严重。47种食用油样品中，花生油、葵花籽油的苯并[a]芘和PAH4超标率均为6.4%；菜籽油苯并[a]芘和PAH4超标率为8.5%和6.4%；米糠油苯并[a]芘超标率为