基因敲除小鼠专家讲座

小鼠基因敲除相关问题介绍基因敲除小鼠专家讲座第1页CONTENTS基因敲除技术原理介绍1基因敲除小鼠基因型判定2基因敲除小鼠喂养和繁殖3基因敲除小鼠专家讲座第2页基因敲除技术原理介绍一、基因敲除小鼠专家讲座第3页1.基因敲除技术介绍基因敲除小鼠技术(knock-outmousetechnology)是指经过基因工程方法使小鼠体内某种基因功效缺失生物学技术。传统基因敲除方法有：①插入突变法②同源重组法③RNA干扰(RNAinterference,RNAi)法当前在同源重组法基础上改良基因敲除技术有：①借助Cre-loxp系统条件型基因敲除法②CRISPR／Cas9技术（棕褐色AA）（白色）（Aa）（Aa）(AA)(AA)（Aa）（Aa）(aa)基因敲除小鼠专家讲座第4页2.基因敲除技术步骤2.1胚胎干细胞分离培养2.1.1首先将129小鼠胚胎分离培养，待胚胎周围逐步形成ES细胞集落。2.1.2然后将ES细胞集落从培养胚胎周围分离。进行一段时间培养后将ES细胞集落吸出分散成单个细胞，将这些单细胞分离出来进行常规培养。2.1.3最终对分离培养ES细胞进行判定。（它应该含有正常二倍体核型及体内外分化能力）

判定方法①把这种胚胎移植到雌性假孕鼠子宫内，是否形成“嵌合体”胚胎。②将ES细胞注入到同种或免疫缺点性小鼠皮下、睾丸或肾包囊，观察注入细胞在宿主动物体内是否形成畸胎瘤。③把受试细胞在体外进行随机自发分化或诱导它们向不一样胚层细胞分化。普通方法是去除喂养层细胞后，ES细胞聚集并形成类胚体。基因敲除小鼠专家讲座第5页2.基因敲除技术步骤2.2构建基因打靶载体依据需敲除基因序列特点设计含有2个标识筛选基因和特定基因同源臂序列靶向载体。以敲除小鼠Fam172a基因为例：靶向载体Fam172a同源序列靶基因基因敲除小鼠专家讲座第6页2.基因敲除技术步骤2.3同源重组2.3.1将打靶载体导入129小鼠ES细胞：当前惯用方法有显微注射法和电穿孔法。2.3.2同源重组筛选：因为哺乳动物细胞中基因随机整合机率要远大于同源重组，所以需要利用选择性标识基因将发生同源重组细胞筛选出来，当前惯用筛选方法有正负双向选择法。基因敲除小鼠专家讲座第7页正负双向选择法neo:正向选择基因。含有新霉素(G418)抗性，其在发生随机组合和同源重组细胞中都可以表示。HSV-tk：负向选择基因。在发生同源重组时别剪切掉，发生随机组合时被保留。tk基因可使无毒丙氧鸟苷（GANC）转化为毒性核苷酸而杀死细胞。neo基因保留，tk基因被切除对G418和GANC都有抗性对G418有抗性，对GANC敏感neo、tk基因均被保留靶向载体筛选出中靶ES基因敲除小鼠专家讲座第8页2.基因敲除技术步骤2.4基因敲除小鼠产生2.4.1将中靶ES细胞注入到BALB/c小鼠囊胚，接种到新培养皿中进行培养。2.4.2将正常发育含ES细胞囊胚移植入受体小鼠子宫内2.4.3嵌合体小鼠判别：经过观察小鼠被毛颜色就可确定嵌合体小鼠。2.4.4基因敲除小鼠制备：因为在同源重组过程中，ES细胞2条染色体中普通只有1条进行重组，得到嵌合体小鼠后，还要经过最少2代繁育过程才能得到基因敲除小鼠。基因敲除小鼠专家讲座第9页基因敲除小鼠基因型判定二、基因敲除小鼠专家讲座第10页1.利用PCR和琼脂糖凝胶电泳判定1.1提取小鼠尾部DNA组织1.2PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳判定基因型1.2.1针对不一样Fam172a+/-，Fam172a-/-，WT设计不一样引物

1.2.2采取PCR仪进行扩增：变性→退火→延伸

1.2.3取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳

1.2.4依据凝胶成像仪中条带判别基因型可能结果分析

Fam172a+/-出现两条带，Fam172a-/-只出现一条带，WT出现一条带，但Fam172a-/-和WT出现位置不同。基因敲除小鼠专家讲座第11页2.利用WB测定组织中FAM172a蛋白水平2.1提取小鼠尾部组织蛋白2.2BCA法检测蛋白浓度2.3WB分析可能出现结果：

WT小鼠条带灰度最高；

Fam172a+/-条带灰度值其次；

Fam172a-/-无条带出现。基因敲除小鼠专家讲座第12页基因敲除小鼠喂养与繁殖三、基因敲除小鼠专家讲座第13页1.喂养基因鼠属SPF级别动物（指机体内无特定微生物和寄生虫存在动物，但非特定微生物和寄生虫是允许存在。普通指无传染病健康动物，是当前国外使用最广泛试验动物）它起源，既可来自无菌动物繁育后代，亦可经剖胎取后，在隔离屏障设施环境中，由SPF亲代动物抚育。小鼠房舍：最好选择能耐药液冲冼、隔音性强、无害虫栖息地方，面积不宜过大。垫料：应选择吸湿性好（如锯木屑）屏障温度：20～25℃湿度：40％～70％照明时间：天天明暗循环12小时。小鼠鼠笼、饲料、垫料和饮水均经高温高压消毒灭菌处理来预防微生物感染，小鼠自由摄食饮水，垫料每七天定时更换3次。幼鼠由母鼠母乳喂养，产后18-22天离乳，雌雄分笼。基因敲除小鼠专家讲座第14页2.繁殖留种：普通选择同胎产仔10只以上、发育良好、均匀、无死亡，适当延长哺乳期至18一22天,体重在18克以上者留种。选出同胎仔鼠将公母分开,放入消毒好鼠笼内,每笼3一5只,切记做好标识,待第一次换窝时再进行复选,按1:1百分比进行选留,区分雌雄,淘汰多出仔鼠。如此重复两三次,效果更佳,首先提升种鼠质量,另方面可防公母混杂,造成早配,影响繁殖率。配种①严格控制动物房灯光：早6到晚6保持照明，晚6到早6保持黑暗，这种光照对对小鼠配种率极为主要。②尽可能不要用嵌合体自交，应选取杂合体进行交配繁殖。③因为小鼠夜间活动力强,正常交配发生于夜晚,故可选3月龄以上、1年以内母鼠于黄昏前放入公鼠笼内合笼。育种①适当增加饲料营养成份，如葵花籽、麦芽等