鸡马立克氏病基因缺失活疫苗sc9-1株的临床安全性试验

鸡马立克氏病基因缺失活疫苗sc9-1株的临床安全性试验

马立克病（md）是由马立克病病毒（sdv）引起的一种高度接触性感染肿瘤。该病毒可通过空气传播,传染力强,被感染鸡产生肿瘤并死亡,给养鸡业造成了巨大的经济损失。MDV属于疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科、马立克氏病病毒属。已发现的有三个血清型,1型为致瘤性的,2型为非致瘤性的,3型是指火鸡疱疹病毒(简称HVT)。MDV的3个血清型中,仅有血清1型病毒MDV-Ⅰ可致瘤,血清2型MDV-Ⅱ和血清3型MDV-Ⅲ均无致瘤性。目前商品化MDV疫苗为致弱的Ⅰ型CVI988/Rispen株、无致病性的Ⅱ型SB1株和Ⅲ型火鸡疱疹病毒(Herpesvirusofturkey,HVT)FC126株近年来随着科技的进步,细菌人工染色体(Bacterialartificialchromosome,BAC)系统目前国内外市场上应用最广泛的马立克氏病疫苗为CVI988/Rispen株细胞结合疫苗,尽管目前已对养鸡场广泛开展了马立克氏病疫苗接种,但马立克氏病肿瘤仍有发生。为此,科学家正在努力进一步改进疫苗。SC9-1株细胞活疫苗已完成实验室及中试的全部研究,临床研究即田间试验正在进行,进一步测试其安全性及免疫保护效力。1材料和方法1.1材料表面1.1.1超毒病毒检测雪山黄鸡、京红蛋鸡、北京油鸡;MDVCVI988/Rispens商品疫苗(梅里亚动物保健有限公司);鸡马立克氏病病毒检验超强毒Md5株(Md5P0602),由山东农业大学动物医学院鉴定、保管和供应;SC9-1株活疫苗中试产品由中试单位提供,批号分别为2014SC901、2014SC902、2014SC903、2014SC904和2014SC905,规格为2000羽份/瓶。1.1.2实验动物和设备冷冻离心机购于Eppendorf公司,生物安全柜与二氧化碳培养箱购于上海力申科学仪器有限公司,SPF鸡隔离器购自苏州冯氏实验动物设备有限公司。1.2方法1.2.1免疫路径1日龄商品代蛋雏鸡与肉雏鸡,颈部皮下接种品种分别为京红1号、雪山黄鸡、北京油鸡。1.2.2测试鸡组临床安全及效力评价试验分组见表1、2。1.2.3观察鸡群的临床症状和临床指标在3个养禽公司进行了10倍剂量安全性试验,分组及免疫情况见表1。在免疫后第一周,每日观察鸡群至少4次,观察鸡群的临床症状(包括鸡的精神、采食、饮水状况),以后每日观察至少2次,试验结束后每组随机抽取10只鸡进行剖检,观察有无MD特异性临床症状和肉眼病变,统计鸡群的死淘率和平均体重。1.2.4比较的有效性试验1.2.4.未免疫情况调查本次SC9-1株疫苗临床效力研究共使用试验鸡41332只,其中雪山黄鸡18000只、京红1号15000只、北京油鸡8032只,同时每组均设100只未免疫对照,均为颈部皮下注射,具体免疫情况见表2。另外,Ⅰ号养殖场3号鸡舍按常规免疫程序免疫CVI988株疫苗的雪山黄鸡,共计11000只;Ⅱ号养殖场5号舍按常规免疫程序免疫CVI988株疫苗的京红1号,共计12500只。1.2.4.发病鸡的观察在免疫后第一周,每日观察鸡群至少4次,观察鸡的临床症状(包括鸡的精神、采食、饮水状态),以后每日观察至少2次;准确记录发病和死亡鸡的数量,并对每只死亡的鸡进行剖检,确定发病和死亡的原因;试验结束后每组随机抽取10只鸡进行剖检,观察有无MD特异性临床症状和肉眼病变,统计鸡群的死淘率和肉鸡的平均体重。1.2.4.攻毒保护试验免疫接种后第6日,分别从3个试验场购回SC9-1免疫鸡和同条件未免疫组对照鸡,SC9-1免疫的鸡分别抽取35只,未免疫对照鸡分别抽取30只,进行攻毒保护试验,攻击强毒为马立克氏病强毒Md5株,1000pfu/0.5mL/只;观察记录攻毒保护情况。另外,分别在Ⅰ号与Ⅱ号试验场抽取CVI988免疫组各35只鸡,于6日龄时分别用鸡马立克氏病强毒Md5株攻毒,1000pfu/0.5mL/只(攻毒后记为“CVI988攻毒组”),与SC9-1免疫组进行攻毒保护效力比较。2结果与分析2.1两组的死价对比分别在3个试验场进行10倍剂量安全性试验。结果显示:雪山黄鸡SC9-1免疫组的死淘率为2.6%,低于未免疫对照组4.0%;京红1号SC9-1免疫组的死淘率为0.5%,也低于未免疫对照组2.0%;北京油鸡SC9-1免疫组死淘率为1.9%,低于未免疫对照组3.0%。对临床死亡的鸡只进行剖检,均未发现异常肿瘤病变;试验结束时分别宰杀10只鸡进行剖检,试验鸡和对照鸡注射部位外观不肿胀,局部无发炎、肿胀、结节等,各脏器组织均无异常肉眼病变,肉鸡增重均未受影响,与相应日龄对照鸡无差异,结果见表3。2.2试验结果剂量2.2.1血不同免疫组的死购率试验结束时剖检,试验鸡和对照鸡各脏器均未见异常。两批SC9-1株疫苗(2014SC902、2014SC904)免疫雪山黄鸡后其死淘率分别为2.7%、2.2%,均低于未免疫组的死淘率5.0%与CVI988活疫苗免疫组的死淘率3.7%;SC9-1株疫苗(2014SC905)免疫京红1号后其死淘率为0.4%,同比未免疫组的死淘率4.0%及CVI988疫苗免疫组的死淘率1.2%要低;SC9-1株免疫北京油鸡后其死淘率为2.1%,同样低于未免疫组的死淘率7.0%。对观察期间死亡的鸡进行剖检,均未发现MD特异性肿瘤病变,结果详见表4。2.2.2sc9-1株疫苗的保护效果观察至90日龄,除了第Ⅲ试验场SC9-1免疫攻毒组有1只鸡(1/35)剖检有MD肿瘤病变,保护指数为96.8%,Ⅰ与Ⅱ两个试验场的SC9-1免疫攻毒组鸡均无异常临床症状和非特异性死亡,内脏器官组织均无异常肉眼病变,保护指数均为100.0%。同时在Ⅰ与Ⅱ两个试验场均增加一组CVI988免疫对照组,结果显示:第Ⅰ试验场CVI988免疫攻毒组6/35出现典型的马立克劈叉、瘫痪神经症状并以死亡告终,剩余鸡只于90日龄剖检,4/35出现明显的马立克肝脏、脾脏与肾脏肿瘤症状;第Ⅱ试验场CVI988免疫攻毒组5/35出现典型的马立克神经症状并以死亡告终,剩余鸡只同样于90日龄剖检,3/35出现明显的马立克心脏、肝脏与肾脏肿瘤症状;Ⅰ与Ⅱ试验场攻毒对照组鸡只均呈现死亡、神经症状与典型马立克肿瘤的特征。两个试验场CVI988组的保护指数分别为71.4%、77.1%,说明SC9-1株疫苗的保护效果更优于CVI988株疫苗。图1~图6为典型MD临床症状和剖检病变,攻毒保护试验结果详见表5。3sc9-1免疫鸡群的临床性能MDV从20世纪60年代前流行毒株以弱毒(mMDV)为主,逐渐产生了强毒株(vMDV),以致于近20年来世界上越来越多的超强毒株(vvMDV),10年前还出现了特超强病毒株(vv+MDV)在三种类型的肉雏鸡或蛋雏鸡进行的临床应用研究共计使用1日龄雪山黄鸡20600只、1日龄京红1号蛋鸡17000只与1日龄北京油鸡9732只。在10倍剂量临床安全性试验观察期内,SC9-1免疫鸡群的精神状态、采食、饮水情况、生长性能与对照组无异。而在使用剂量临床安全性与免疫效力对比试验观察期间,将免疫SC9-1的鸡群与免疫CVI988/Rispens(市售)鸡群进行了对比,SC9-1免疫组鸡群的死淘率分别为2.7%与0.4%,均低于CVI988/Rispens的3.7%与1.2%(P>0.05)。由于我国还没有出现特超强毒(684A)的报道,所以本次临床应用研究的攻毒保护试验使用了马立克超强毒Md5株。临床试验鸡免疫SC9-1株细胞活疫苗并以vvMd5攻毒后均长势良好,除了北京油鸡免疫攻毒组有1只鸡(1/35)剖检有MD肿瘤病变,保护指数为96.8%,另外,2个场的免疫攻毒组试验鸡均无异常临床症状和非特异性死亡,内脏器官组织均无异常肉眼病变,保护指数均为100.0%,而CVI