抗wssv克氏原螯虾胶体金免疫层析试纸条的优化及初步应用

抗wssv克氏原螯虾胶体金免疫层析试纸条的优化及初步应用

白虾病是由非标准白色斑点病毒（wssv）引起的疾病。在第三种和第三十二天内，日本虾的发病率可以达到100%。从1993年首次暴发以来，每年对日本虾业造成重大的伤害。目前,生产实践中较普遍的通过苗种检疫、生态调控改善养殖环境、饲料中添加免疫增强剂等措施预防控制白斑病发生目前常用的病原检测方法主要包括普通PCR、实时定量PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)和胶体金免疫层析试纸条。普通PCR、实时定量PCR具有较高的灵敏度1材料和方法1.1病害虾池sis患白斑病的中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)取自青岛附近养殖场的患病虾池。克氏原螯虾(Procambarusclarkii)购自青岛某水产品批发市场。抗WSSV单抗杂交瘤细胞株2E6、2A3、3B7、4G9、5D2由本实验室制备1.2wssv纯度取患白斑病中国明对虾的鳃,每克虾鳃加入TNE缓冲液(Tris-HCl1.566g,NaCl5.844g,EDTA-Na1.3细胞培养和渗透将-80℃冻存的抗WSSV杂交瘤细胞株2E6、2A3、3B7、4G9、5D2放入37℃水浴中迅速融化,1000r/min离心3min,弃去上清液,加入1mL37℃的GIT细胞培养基(日本NihonSeiyaku公司),将细胞重悬、吹匀后,吸入24孔培养板中(Corning,USA),于37℃下4.5%CO取腹水按1∶2(V/V)加入乙酸缓冲液,逐滴加入辛酸(1mL腹水加33μL辛酸)搅拌30min,4℃静置2h;经12000r/min离心30min,上清液经0.45μm滤膜过滤后,加入1/10体积的0.1mol/LPBS,用1mol/LNaOH溶液调节pH至7.4,加入饱和硫酸铵溶液使其浓度为45%,冰浴下搅拌30min,4℃静置2h;12000r/min离心30min,沉淀用适量0.01mol/LPBS溶解后在4℃下透析3~4次,每次约4h。SDS鉴定抗WSSV单抗的纯度和类型,间接免疫荧光技术鉴定单抗的特异性,间接ELISA测定单抗的效价。1.4wssv胶体金免疫分析试剂包的优化1.4.1试纸条的制备用相同的抗WSSV单克隆抗体溶液分别在3种型号的试纸条NC膜(WhatmanAE99、Whatman135、Whatman180,上海杰一生物公司)划上检测线,质控线为羊抗鼠IgG(Sigma),待NC膜干燥后,浸没在3%BSA中于37℃下封闭1h,PBST洗涤3次,每次5min,晾干。金标垫用金标抗体Au-2E6浸润后于37℃下干燥。将塑料底板、标签纸、样品垫、金标垫、吸水纸、3种型号的NC膜分别组装成3组试纸条。用这3组试纸条分别检测相同的WSSV溶液,0.01mol/LPBS溶液作为阴性对照。1.4.2试纸条的制备制备金标抗体Au-2E6和Au-2A3,将Au-2E6和Au-2A3按不同体积比混合,A组为Au-2E6,B组为Au-2A3,C组、D组和E组Au-2E6和Au-2A3分别按1∶1、2∶1和1∶2混合。将5组金标抗体浸润金标垫后干燥。使用1.4.1中确定的NC膜,将5种金标垫和其他试纸条耗材组装成5组试纸条。用这5组试纸条检测相同的WSSV溶液,0.01mol/LPBS溶液作为阴性对照。1.4.3检测线抗体最适将单抗2A3、3B7、4G9、5D2按不同体积比混合,A组2A3∶3B7∶4G9∶5D2=1∶1∶1∶1;B组2A3∶3B7∶4G9∶5D2=2∶4∶2∶1;C组2A3∶3B7∶4G9∶5D2=1∶2∶1∶1;D组为3B7。将这4组混合单抗分别在1.4.1中确定的NC膜上划出检测线,用1.4.2中确定的金标抗体制备金标垫,组装成4组试纸条。用这4组试纸条检测相同的WSSV溶液,0.01mol/LPBS溶液作为阴性对照。1.5wssv检测按照1.4确定的试纸条优化条件制备WSSV胶体金免疫层析试纸条。将1.2中纯化的WSSV溶液从10倍到20480倍按2倍等比稀释成不同浓度的病毒溶液,用优化的试纸条分别对其进行检测,阴性对照为0.01mol/LPBS溶液。1.6wssv的培养实验组和对照组各200只健康克氏原螯虾(约20g/只)(PCR检测无WSSV感染)暂养一周后,水温逐渐升至25℃。实验组投喂注射了WSSV的鲜活花蛤,对照组投喂不含WSSV的鲜活花蛤。感染后的96h内,每隔12h各随机选择8只活虾,取鳃、血淋巴、肠、心脏、性腺、肌肉和肝胰腺。血淋巴按1∶1(V/V)加入抗凝剂;其余组织按每1g组织加入2mL0.01mol/LPBS冰浴研磨3~5min,4℃下4000r/min离心10min,取上清液,用试纸条进行检测。2结果2.1间接免疫荧光结果2E6、2A3、3B7、4G9、5D2腹水经纯化后,单抗浓度分别为10、5、8、4和2mg/mL。SDS结果显示,5种单抗分别在50kDa和25kDa有清晰的条带(见图1),没有明显的杂带,说明纯化效果较好;且5种单抗均为IgG类型。间接免疫荧光结果显示,2E6、2A3、3B7、4G9的荧光强度较强,5D2的荧光强度相对较弱;阴性对照无特异性荧光(见图2)。间接ELISA结果显示,单抗2E6、2A3、4G9的效价均为12800,3B7的效价为25600,5D2的效价为3200。2.2wssv胶体金免疫分析试剂包的优化结果2.2.1wssv的测定3种型号的NC膜WhatmanAE99、Whatman135、Whatman180组装的试纸分别检测相同的WSSV溶液,结果显示,WhatmanAE99的检测线显色最深,Whatman180次之,Whatman135的显色最浅。说明WhatmanAE99制备的试纸条的灵敏度最高,因此确定WhatmanAE99作为WSSV胶体金免疫层析试纸条的NC膜。2.2.2金标抗体的确定金标抗体Au-2E6和Au-2A3按照不同的体积比混合后,分别制备5组试纸检测相同的WSSV溶液,当Au-2E6∶Au-2A3按1∶1(V/V)混合时,试纸条检测线显色最深,因此确定WSSV胶体金免疫层析试纸条的金标抗体Au-2E6和Au-2A3按1∶1(V/V)混合。2.2.3检测线抗体的混合比例抗WSSV单抗2A3、3B7、4G9、5D2按4种不同体积比混合后作为检测线抗体,组装的4组试纸条检测相同的WSSV溶液,结果显示,2A3∶3B7∶4G9∶5D2=2∶4∶2∶1(V/V)时,试纸条显色明显比其他3组更深(见图3),因此确定2A3、3B7、4G9、5D2按2∶4∶2∶1比例混合作为WSSV胶体金免疫层析试纸条的检测线抗体。2.3wssv检测的优化电镜观察发现纯化的WSSV病毒粒子完整、数量较多、纯度高(见图4),考马斯亮蓝法测定WSSV溶液的蛋白浓度为1.2mg/mL。纯化的WSSV溶液从10倍到20480倍按2倍等比稀释成不同浓度的病毒溶液后,用优化的试纸条检测,结果显示,随着WSSV溶液稀释倍数的增加,试纸条检测线显色由深红色逐渐变浅;当纯化的WSSV溶液稀释倍数为10240倍时(WSSV蛋白浓度为117.2ng/mL),试纸条检测线显浅红色,当纯化的WSSV溶液稀释倍数为20480倍时,试纸条检测线不显色。阴性对照的检测线不显色,所有试纸条的质控线都为明显的红色。由此确定该试纸条的检测限为117.2ng/mL(见图5)。2.4感染wssv的克氏原螯虾组织相关指标检测结果感染WSSV后不同时间点,取克氏原螯虾血淋巴及鳃、肠、心脏、性腺、肌肉、肝胰腺的粗提液用试纸条进行检测。结果显示,感染WSSV12h的克氏原螯虾组织中,肠最先检测为阳性;感染WSSV后24h时,鳃、血淋巴、肠、心脏、性腺、肝胰腺的检测结果为阳性,肌肉检测结果为阴性;36h时各组织的检测结果均为阳性,其中试纸条检测线显色由深到浅的次序依次为肠、性腺、血淋巴、鳃、心脏、肝胰腺、肌肉(见图6)。阴性对照组克氏原螯虾各组织在不同时间的检测结果均为阴性。3wssv胶体金免疫层析试纸条的制备WSSV的纯度会影响试纸条检测限的准确测定。如果纯化的WSSV纯度不高,其中的杂蛋白会使测得的WSSV浓度比实际浓度大,从而使试纸条的检测限高于实际值。WSSV的囊膜比较脆弱,在纯化过程中,经常发现病毒粒子的囊膜破损、脱落,不易得到完整的病毒粒子,有时纯化的病毒溶液含有大量的杂质。本文采用姜有声等单克隆抗体的生产方法包括腹水法、实体瘤法和体外培养法,腹水法比实体瘤法和体外培养法有更多优点。体外培养法获得的杂交瘤上清液中单抗浓度较低;实体瘤法收集的血清中单抗的含量较高,但是获得的血清量较少;采用腹水法生产单抗,每只小鼠可收集腹水5~10mL,且腹水中单抗浓度较高本文主要从NC膜、金标抗体和检测线抗体3个方面对WSSV胶体金免疫层析试纸条进行了优化。金标抗体在孔径大的NC膜中的前进速度较快,但灵敏度较低;在孔径小的NC膜中前进速度较慢,灵敏度较高,但孔径太小容易产生假阳性。本文选择WhatmanAE99NC膜制备的WSSV胶体金免疫层析试纸条,灵敏度较高,无假阳性。考虑到试纸条实际使用过程中,待测样品中可能含有少量不完整的病毒粒子,本文将2种分别抗WSSV囊膜蛋白和核衣壳蛋白的单抗混合后制备成金标抗体,能够结合完整的病毒粒子和不完整的病毒粒子,从而提高试纸条的灵敏度。检测线单抗的选择也会影响试纸条的