火龙果中多糖及其他次生代谢产物的提取

火龙果中多糖及其他次生代谢产物的提取

0dna分子标记的应用龙眼又名红龙果、仙蜜果、情人果等，是仙人掌科的一种具有天然尺和三角柱的植物。它来自中国大陆。这是亚热带和亚热带的著名水果。目前各地栽培种植的火龙果主要有红皮红肉、红皮白肉以及黄皮白肉系列,笔者在进行火龙果引种研究中发现,各系列尚有许多表征不同的类型,且各类型间在产量、品质等方面都表现出一定差异。为了进一步明确各类型的遗传差异性,则需要应用DNA分子标记进行分子评价及种质分析。目前植物分子标记的研究多采用ISSR进行,它是由Zietkiewics等提出的一种锚定SSR的新策略,是建立在PCR反应基础上的一种新型分子标记技术试验以火龙果嫩茎为试材,通过多种DNA提取方法比较研究,旨在寻求火龙果基因组总DNA提取的有效方法,以便更好地进行火龙果各类型遗传背景研究。1材料和方法1.1试材的选择火龙果样品采自福清三华农业有限公司的火龙果生产基地,选取红皮深红色果肉与红皮白肉的火龙果嫩茎作为试材。样品采集后装于自封袋中并做好标记,置于-80℃冰箱中保存备用。1.2dycp-33a型电泳槽台式高速冷冻离心机(Beckman),TU-1810紫外可见分光光度计,恒温水浴锅,DYCP-33A型电泳槽,DYY-6C型电泳仪,SyngeneGeneGenius凝胶成像系统,超低温冰箱等。所用试剂中DNAMarker为TaKaRa公司产品,RNaseA为sigma公司产品,其余均为国产分析纯试剂。1.3总提取方法1.3.1传统ctag法1.3.2萃取ctab法1)称取火龙果嫩茎1.0g,加入0.1gPVPP于冰冷的研钵中用液氮研磨成细粉,装入10mL灭菌的离心管中。2)迅速加入65℃预热的CTAB提取缓冲液(50mmol/LTris-HCl;20mmol/LEDTA;1.4mol/LNaCl;2%CTAB,临时前加入2%β-巯基乙醇)4mL,混匀,在65℃水浴中温浴裂解45min,期间不断摇匀,每隔10min摇动1次。3)4℃下12000g离心20min。4)将上清液转入到洁净的灭菌离心管中,加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)抽提,将其上下颠倒混匀,4℃12000g离心10min,取上清液。5)将上清液小心转移到新的离心管中,加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,轻轻摇动,使其充分混匀,置于-20℃下30min。6)4℃下13000g离心10min,弃上清液,可见絮状沉淀,即为DNA沉淀,用牙签挑出,装入0.5mL离心管。1.3.3离心液-异戊醇法1)称取火龙果嫩茎0.1g,加入PVPP于冰冷的研钵中用液氮研磨成细粉,装入1.5mL灭菌的离心管中。2)迅速加入70℃预热的CTAB提取缓冲液(100mmol/LTris-HCl;20mmol/LEDTA;1.4mol/LNaCl;2%CTAB;5mmol/LAscorbicacid;4mmol/LDIECA)600mL,并加入10μLβ-巯基乙醇,混匀,在振荡器上振荡20s。3)加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)抽提,将其上下颠倒混匀,并轻轻振荡,常温10000g离心5min,取上清液。4)将上清液转入到洁净的灭菌离心管中,加入2/3体积或等体积的-20℃预冷的异丙醇,轻轻摇动,使其充分混匀,置于-20℃下5min。5)4℃下14000g离心20min,弃上清液,可见絮状沉淀,即为DNA沉淀。1.4凝胶电泳取少量上述提取的DNA溶液,在紫外分光光度计下测定波长260nm、280nm的吸光值OD取微量的火龙果DNA点样于0.8%~1.0%的琼脂糖凝胶电泳中进行电泳,在电压130V、电流300A电泳30min,EB(溴化乙锭)染色15min,凝胶成像扫描保存。2结果与分析2.1dna的降解试验所提取的火龙果DNA为白色或透明絮状沉淀。通过电泳图谱(图1~3)可看出,3种方法提取总DNA的效果各有不同。如图1所示,常规CTAB法提取火龙果总DNA的效果最差,电泳后无主带产生,说明DNA未良好提取或在提取过程中已降解,同时还有未降解完全的RNA存在。而改良CTAB法与微量CTAB法提取火龙果总DNA较常规CTAB法效果好,均能有效提取到DNA,电泳图谱主带清晰,说明所提取的DNA完整性较好,基本上无断裂。此外,试验图谱显示(如图2),改良CTAB法点样孔有点亮,这说明该样品中仍含有未被除去的多糖及其他一些次生代谢物质,这些物质具有粘连性,从而使得DNA分子无法全部离开点样孔或电泳速度较慢,在点样孔上形成亮点,同时,RNA没有去除干净,因而有两条带。微量CTAB法所提取的DNA呈现一条清晰整齐的主带(见图3),DNA基本无降解现象,RNA降解完全,说明该方法能有效去除火龙果嫩茎中的多糖及其他次生代谢物质,为火龙果总DNA提取的有效方法。试验显示不同火龙果类型间存在一定的差异,深红果肉火龙果提取的DNA效果要优于白肉火龙果。2.2紫外分光光度计检测结果将试验中3种不同的方法提取的火龙果DNA,应用紫外分光光度计进行吸光值检测,其结果如表1。传统CTAB法提取得到的DNA溶液进行紫外分光光度计检测无法获得有效值,说明DNA基本已经降解,与电泳检测结果相同。而用改良CTAB法和微量CTAB法所提取的DNA溶液其OD3dna的提取不同的植物种类DNA提取的难易不同,此外,试材选择、提取方法、操作技术、环境因素等也会对DNA的提取结果产生影响。该试验研究表明,用微量CTAB法可以简便、快速地从火龙果嫩茎中提取到适合于进行ISSR分析的DNA。而传统CTAB法无法提取到理想的火龙果DNA,这可能与火龙果本身的特性有关,如它的植株材料中含有较多的次生代谢物质、多糖以及植醇等。在进行火龙果总DNA提取时要注意以下几个方面。见Shen等针对火龙果多糖、粘稠的特性,参考有关基因组DNA提取的资料7)用75%乙醇洗2遍,吹干,加入100μLTEBuffer(10mmol/LTris-HCl,pH8.0;10mmol/LEDTA,pH8.0)溶解,放置在-20℃冰箱中保存。由于火龙果茎黏性大,样品多时对研磨转管不利,在参考一些有关植物DNA微量提取法的文献[10-11]后,进行了适当的改进。具体步骤如下:6)用75%乙醇洗沉淀2遍,吹干,加入100μLTEBuffer(10mmol/LTris-HCl,pH8.0;10mmol/LEDTA,pH8.0)溶解,放置在-20℃冰箱中保存。1不同立地条件对dna提取的影响有研究表明,植物组织中的多糖或酚、酯、萜等次生代谢物质会对DNA提取造成较大的困难,样品不纯,会抑制后续酶解和PCR反应,并且这些物质随着植物组织的增长而增加2研磨和离心管制备对于植物的DNA提取而言,充分研磨可破碎细胞壁和细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中。火龙果嫩茎中含有大量粘液状的物质,因此要求研磨时要迅速,加入液氮后动作要快,边研磨边补充液氮,勿让材料融化,防治其粘在研钵底部,影响转管。研磨要越细越好,当获得白绿色的粉末后要立即转入离心管,否则就会变粘稠而影响后面的裂解。细胞裂解是细胞释放DNA的前提。在微量CTAB法中,要求在得到粉末后立即加入预热的CTAB提取缓冲液并振荡,振荡可使其充分混匀,以便及时钝化组织破碎时DNA酶的活性;但是动作要尽量温和,以免影响DNA得率。3得率失越大,得率越大通过比较研究发现,试验中间步骤越多,对DNA损失越大,得率越小。因此要尽量简化步骤。同时,在试验中,避免酚的使用,直接采用氯仿-异戊醇抽提,减少酚对人体的伤害以及残留对后