大学生创新型实验实验报告(一)

大学生创新实验实验报告（一）在第一个月的大学生创新实验中，我主要是学习、熟悉基本操作，阅读课题相关文献。所学的基本操作有：仪器的洗涤、柱层析、减压蒸馏；阅读文献为：《N_取代马来酰亚胺巯基荧光探针的研究进展》该文献为本实验课题综述，它评述了测定含—SH生物活性物质如肽、蛋白质等的N—取代马来酰亚胺荧光探针的种类、性能、原理、应用及其进展。巯基(—SH)是细胞中化学活性最高的基团。在蛋白质中,—SH部分是与酶活性有关的最具有反应性的官能团,能保护细胞不受缺氧、毒素、诱变、放射线及许多致癌物的侵害。所以鉴别和定量测定生物巯基化合物日益受到关注。传统的检测方法如：硝普盐法、碘量法、电流分析法、分光光度法、比色法等灵敏度低,不能适应有些生物样品中巯基化合物的测定。因此，我们的实验最终目的即为合成一些高灵敏的分析检测试剂,新型的荧光—SH衍生试剂成为研究的焦点。—SH荧光探针具有灵敏度高、可以直接测定含—SH化合物与试剂的反应速度等优点，具体的—SH荧光探针已报道的有三类：芳基卤化物、丹磺酰氮丙啶类：好的选择性和灵敏度，对—SH的检测限一般可达10-12mol，但自身都有较强的荧光,衍生产物必须经过分离才能进行检测,一般用于HPLC柱前衍生。苯并呋喃磺酰卤：其自身荧光较弱,一般需在碱性条件及高于室温下与—SH衍生。乙酰卤衍生物：主要是碘乙酰胺衍生物和马来酰亚胺衍生物，最常用来衍生—SH,它们与—SH反应快,在室温及生理pH下即可进行,但前者与—SH的加成产物在水解时易失去荧光团,且其自身对光不稳定，而马来酰亚胺类荧光探针与—SH的加成产物比较稳定,它自身荧光很弱,在与—SH加成后荧光增强,这种仅在反应中荧光增强的特性使其表现出独有的优越性。因此我们的研究重点在N—取代马来酰亚胺类巯基荧光探针(简称N—MTFP)。N—MTFP广泛用于化学、生物、医药等方面,主要用于反相HPLC分离、检测巯基化合物。我们合成新的性能优良的N—MTFP应具的特点：具有长的荧光发射波长和大的斯托克斯位移；荧光量子产率(Φ)应对生理pH值不敏感；具有长的荧光寿命；具有好的光化学稳定性；马来酰亚胺中的氮原子与荧光团之间用σ键隔开。N—MTFP检测巯基的反应原理如下:荧光团在引入马来酰亚胺环后,由于n、π*转移发生在马来酰亚胺环上,使荧光探针I的量子产率显著下降，当这个环的双键与—SH加成而饱和或加成物的环通过水解被打开,母体的荧光又恢复。N—MTFP一般都具有较低的量子产率,仅在与—SH反应后荧光增强,而I自身的水解产物II的荧光也很弱,且I与—SH加成的速度比I自身水解的速度大得多,所以可以通过荧光强度的变化来检测含—SH化合物。这种检测的优点是在很多情况下可以不必从反应体系中移走未反应的试剂。为了提高N—MTFP的选择性和灵敏度,已开发和研究了具有不同荧光团的N—MTFP,这些荧光探针按其荧光团分类主要有以下几种:注：化合物(3)~(6)在量子产率及斯托克斯位移方面显著优于其它已有的荧光试剂。研究表明,在生理pH条件下,化合物(3)、(4)对活性细胞中GSH的检测选择性优于CPM;化合物(6)对GSH的灵敏度是DACM的两倍[7]。化合物(7)还易形成比其单体具有更长发射波长的激—基复合物而可能作为一种DNA嵌入试剂[1]荧光探针类型实例优点缺点香豆素类香豆素衍生物具有较强的荧光,且荧光发射波长大于蛋白质自身的荧光DACM自身无荧光,形成的荧光衍生物发射波长较长,溶于水,不易光漂白,具有大的斯托克斯位移和高的吸光系数,这一化合物由于价格高而不适于常规应用CPM注吨类荧光素、罗丹明及曙红马来酰亚胺它们都具有较长的荧光发射波长和与—SH反应后高的量子产率(Φ)较小的斯托克斯位移,且其量子产率对生理pH敏感苯并杂环类含有水溶性阳离子吡啶鎓盐的苯并唑类N—MTFP有较大发射波长荧光特性好,改变其杂环母体或环上的取代基还可改变试剂的检测灵敏度发射波长较短根据实际情况合成符合要求的荧光探针。另外，我还学习了柱层析等基本操作，到现在为止我所学过的分离提纯方法有：蒸馏、重结晶、减压抽滤（过滤）、萃取、柱层析、减压蒸馏、水蒸气蒸馏蒸馏：用于分离沸点相差较大的液体混合物减压蒸馏：在低温蒸馏出高沸点或高温易分解物质，用于液体混合物重结晶：利用溶解度差异，分离固态混合物抽滤（过滤）：用于分离固液混合物萃取：利用溶质在不同溶剂中溶解度不同来分离液态混合物水蒸气蒸馏：使挥发性组分随水蒸气一同蒸出，适用于具有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏、在水中稳定且难溶或不溶于水的药材成分的提取。在分离出产品后一般需检测产品纯度，现在我所学过的检测纯度的方法有：测熔点、沸点，测折光率，薄层法熔点：毛细管法，检测固体纯度沸点：利用液态达到沸点时外界压力等于蒸汽压的原理，检测液体纯度折光率：使用阿贝折光仪测折光率，检测液体纯度薄层法：利用溶解度差异，检测液体纯度柱层析流程：空梨形瓶称重→加入样品溶液→（减压蒸馏抽干）→固体样品称重→加入硅胶（质量为样品的2~3倍），用CH2Cl2溶解→再次抽干(抽干时开始装柱)→样品、硅胶混合物粉末→粉末加入柱中，梨形瓶中剩余粉末用乙酸乙酯溶解→用乙酸乙酯溶解的样品做薄层法，溶剂由一定比例的二氯甲烷和乙酸乙酯配制，当Rf2/Rf1=0.3时溶剂的比例合适→用石油醚润柱，当柱全部被石油醚润湿后可以加压→加入适当比例的二氯甲烷、乙酸乙酯混合溶剂→收集滤出液→定时用薄层法检测溶质含量→到一定纯度时开始收集产物（继续检测）→当溶质亮点消失时停止收集。柱层析装置图：（瓶顶可加上加压装置）柱层析原理:柱层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使各组分分离。一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。硅胶柱层析流动相：极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸，利用极性相似相容原理，本次实验是用乙酸乙酯、石油醚系统，乙酸乙酯极性大，石油醚极性小。装柱的顺序为棉花、无水Na2SO4、硅胶、样品硅胶混合粉末、无水Na2SO4（样品的1.5倍左右）。开始收集标志：用层析法与标准样品对比，液滴亮点分离。结束收集标志：液滴在硅胶板上的亮点消失。注意：减压蒸馏