基于药效物质的中药品质调控关键技术体系

基于药效物质的中药品质调控关键技术体系中药品质保障与提升--国家发展战略NATURE，2007，448：126~128《中药现代化发展纲要》中药要实现现代化、国际化，必须解决品质问题2

总体研究思路中药有效成分如何产生？有效成分含量怎样提升？中药有效成分是什么？基于药效物质的中药品质调控中药有效成分如何来？紧密围绕功效，阐明中药有效成分解析中药有效成分生源途径开发调控策略，提高有效成分含量保障和提升中药品质3被动筛选到主动创制

生源途径解析面临技术障碍4代谢流化学轮廓是生源途径最重要的组成部分，目前的技术手段难以系统表征，存在极大的技术挑战PlantCell,2013,25:694–714CurrentOpinBiotech,2013,24:310–319催化酶信息远不能满足研究需求，特异性催化酶的发现及功能评价难度高亟需技术创新！限速步骤是实现有效调控的关键环节，但仅靠“试错”来确定，效率低MolecularSystemsBiology,

2009,5:1-14中药有效成分生源途径解析生物合成调控机制解析次生代谢工程策略发掘生物合成途径表征转录调控网络构建关键转录调控因子挖掘关键途径基因确认靶标代谢调控整体代谢调控5中药品质调控关键技术体系

1.基于多平台的中药植物的代谢组分析平台UntargetTarget药材及原植物、工程菌株的化学指纹图谱活性成分代谢流的追踪重要化合物的识别定量

一、中药有效成分生源途径解析建立系统表征代谢流化学轮廓技术7HuangB…ChaiY.F.*,ChenW.S.*

Metabolomics2011,7,134DiP…ChenW.S.*ACSChemBiol.2013,cb3006962同位素示踪动态监测外源干预Q-TOF结构鉴定LC-MS定量分析成功应用于丹参酚酸类成分代谢流化学轮廓表征

阐明了丹参酚酸类成分生源途径注：红色为本课题组的新发现8丹参酚酸B阐明了丹参酚酸类成分生源途径XiaoY…ChenW*,ZhangL.*

BiosciRep,2010,30,33DiP…ChenW.S.*ACSChemBiol.2013,cb3006962生源途径解析取得重要突破2、

药用植物的转录组分析平台CrocussativusSalviamiltiorrhizaIsatisindigoticaErigeronbreviscapusBaphicacanthuscusiaArtemisiacarvifoliaDeepsequencingUnigenesDeepanalysisDatasetsChenJ...ChenW*BMCgenomics.2013LiQ…ChenW*BMCgenomics.2014ChenR…ZhangL*PloSOne,2015ChenJ…ChenW*Gene.2015TanH…ZhangL*Mol.Plant.2015

作为非模式物种，药用植物转录调控的解析难度巨大构建了菘蓝木脂素生物合成转录调控网络

构建了菘蓝木脂素生物合成转录调控网络GenenameReferencegenenameERF15AT2G31230ERF21OsAP21WRKY59AT2G21900bHLH62-2AT3G07340bHLH77AT3G23690bHLH99AT5G65320MYB18AT4G25560MYB94AT3G47600TNYAT5G25810EBPAT3G16770ChenJ,…ChenW*.PlantBiotechnologyJournal,revised代谢组、转录组整合分析解析板蓝根活性成分的合成、调控特征

HuangB…ChenW.S.*

MolBioRep.2008,35,601HuYS…ChenW.S.*

MolBioRep.2011,38,2075KaiG.*MetEng.2011,13,319Xiaoy…ChenW.S.*PlosOne2011,63、创建化学与生物学融合的催化酶发掘方法12完成丹参两个主要活性成分途径所有催化酶的功能研究体内外功能验证预测催化反应靶向甄别提出生源假说分子克隆二.生物合成调控机制解析——Farr′eetal.AnnualReviewofPlantBiology.2014.65:187–223功能基因调控机制的解析是目前植物代谢工程的挑战

研究基因功能解析调控机制功能基因调控机制解析的研究平台

1.丹参SmMYC2转录因子的功能研究SmMYC2a

和SmMYC2b的细胞核定位特征SmMYC2a和SmMYC2b与JAZ蛋白互作参与JA信号转导调控有效成分的生物合成酚酸途径丹参酮途径抑制SmMYC2a和SmMYC2b均显著降低丹参酚酸和丹参酮途径基因的表达16

对有效成分生物合成途径基因的影响抑制SmMYC2a抑制SmMYC2b17抑制SmMYC2a和SmMYC2b均显著降低丹参酮和酚酸类成分的积累

对有效成分积累的影响18SmMYC2a和SmMYC2b与JAZ蛋白互作参与JA信号转导调控有效成分的生物合成

SmMYC2与JAZ蛋白的相互作用ABZhouY,…ChenW*.ScientificReports.revised19揭示了SmMYC2调控丹参有效成分生物合成的分子机制

SmMYC2与丹参有效成分合成途径基因的转录调控腺毛青蒿素青蒿TAR1：一个参与青蒿腺毛

发育的转录因子细胞核定位特性在青蒿幼嫩叶片尖端的分生组织、腺毛以及花苞中表达在幼嫩叶片的细胞核中表达20

2.青蒿腺毛发育相关转录因子TAR1的研究

脱叶绿素实验21抑制TAR1导致腺毛发育异常和蜡质合成减少TAR1调控青蒿腺毛的发育

72%75%75%青蒿素青蒿酸二氢青蒿酸叶花苞22抑制TAR1显著降低青蒿素、青蒿酸、二氢青蒿酸的生物合成

TAR1影响青蒿有效成分的积累

TanH,…ChenW.MolecularPlant2015;8(9):1396–41123揭示了TAR1调控青蒿素合成的分子机制TAR1与青蒿素合成途径基因的相互作用

三、次生代谢工程策略的研究两种策略靶向调控整体调控提高有效成分含量

R-valueLariciresinolIiPLR10.981IiPLR2-0.013IiPLR3-0.018251、构建“基因－化合物”关联谱挖掘关键酶

XiaoY…ChenW.S.*

PlosONE2011,6(12):e29713TATHPPRHPPDC4H靶向调控策略—目标有效成分含量提高激活合成途径抑制代谢旁路26vsWT3.3vsWT4.4丹参酚酸类成分含量提高RA4.4倍LAB3.3倍

*WTCKIiPLR1-RNAiIiPLR2-RNAiIiPLR3-RNAipale

5%ofWT3.6%ofWT20%ofWT2.2%ofWT27IiPLR1是菘蓝落叶松脂素生源途径的关键酶Deeperpurple6.3-foldXiaoY…,ChenW.*JournalofExperimentalBotany2015;66(20):625928IiPLR1靶向调控大幅提高菘蓝落叶松脂素含量

SubstrateKm(μM)Vmax(μM/min)Kcat(min-1)kcat/Km(μM-1min-1)Pinoresinol63.41.7662.80.99Lariciresinol2.600.114.051.55IiPLR1IiPLR1SecoisolariciresinolPinoresinolLariciresinolControlsubstratespecificity29活性木脂素非活性木脂素M123UnpublisheddataIiPLR1对目标化合物的精准调控

Apo(2.69Å)PLR+Sec(2.61Å)PLR+Lar(2.8Å)PLR+Pin(2.4Å)FourstatesSubstrateSpecificityX-raySubstrateKm(μM)kcat/Km(μM-1min-1)Pin2.49.7Lar//19位色氨酸突变显著提高了IiPLR1对松脂醇的专属性，催化效率提高约10倍！

Unpublisheddata30IiPLR1催化机制探索

QiaoCetal.,ActaBotSin1989四倍体菘蓝——多倍体育种优良品系

ABDiploidTetraploidrootproduction10~18%leaveproduction25%EnhancedresistanceHigherantiviralactivitiesFunctionalcharacterizationProbesetAGItetraploidvsdiploidp-value*TranscriptionfactorWRKYfamilytranscriptionfactor267028_atAt2g3847040.999034WRKYfamilytranscriptionfactor267246_atAt2g302502.30.996645WRKYfamilytranscriptionfactor161892_atAtlg808401.90.996645WRKYfamilytranscriptionfactor267469_atAt2g305901.50.995927WRKYLuB,ChenWetal.PlantMolBiolRep

2006312、整体调控策略——转录调控因子

WRKYdomainsZinc-fingermotifs揭示了两种倍性菘蓝品质差异的分子基础:

WRKY33、WRKY34、WRKY48、WRKY49和WRKY50的表达差异centralnodesinplantdefense32菘蓝WRKY转录因子的发现与功能评价

MeJA(0.5μM)WRKY34：PositiveRegulator33挖掘落叶松脂素合成的关键转录调控因子

XiaoY,…ChenW*.ACSChemicalBiology,underreview首次提出WRKY转录因子在多倍体进化中的重要作用

7.8-fold34初步阐明四倍体菘蓝优良品质形成的分子机制

基于外源基因的代谢调控策略ZhaoS*…JournalofExperimentalBotany2015玉米C1转录调控因子调控丹参中活性成分的合成C1通过不同模式调控丹参萜类及酚酸类两个pathway的转录

C1对不同活性成分的合成具有不同调控模式C1可以提高丹参酮类成分的水平C1抑制丹参酚酸类成分合成C1显著提高花青素的的合成，对黄酮类化合物无显著影响3.44fold总丹参酮

迷迭香酸酚酸B酚酸A基于植物激素功能的调控策略有效成分含量提高6.5倍外源添加系统评价内源性诱导因子功能发现甲基茉莉酸（MeJA）的高效调控作用XiaoY…ChenW.S.*,ZhangL.*PhysiolPlant2009,137,1GuX.C…ZhangL.*,

ChenW*PlantCellRep2012,31,2247遗传改造内源信号分子合成通路丹参有效成分含量广泛提高RA2.2倍LAB1.8倍TanIIa16.6倍获得了稳定遗传的优良株系基于植物激素功能的调控策略2、阐明多种中药材优良品质形成的分子机制1、建立道地药材品质特征数字化数据库3、完成多种重要药材优质种质资源的选育主要科技创新四、学术成果1、文章发表工作得到了国际同行的广泛认可，相关SCI论文81篇发表于A.C.S.Chem.Biol.(IF=5.6);Mol.Eng.(IF=8.3);J.Exp.Bot.(IF=5.3);Mol.Plnat(IF=6.3)等主流期刊。单篇最高引用次数达58次2、发明专利

相关成果申请专利21项，获得授权专利17项3、科技奖励

获得上海市优秀学科带头人、

J.Integr.PlantBiol.2010最佳年度研究论文ActaPhysiolPlant,2012,34:1501基于“基因-化合物”关联谱的关键步骤发现新方法已被5个课题组成功应用解决了关键限速步骤难以确定的问题41学术评价

PlantPhysiology2011,157:1067thePlantJournal

2012,71:85042HPPR功能的发现为4-羟基苯丙酮酸生物合成通路提出了全新机制TAT等催化酶的发现对全面诠释苯丙烷类生源途径具有重要价值学术评价