胶原诱导型关节炎大鼠模型的建立与药物干预的评价

胶原诱导型关节炎大鼠模型的建立与药物干预的评价

类风湿性关节炎（ra）是一种生长缓慢、系统性自身免疫性疾病，主要以关节和关节周围组织的非感染性炎症为主，其特征性病理改变为滑膜炎和滑膜增生，最终导致软骨侵蚀和关节破坏。1材料和方法2结果2.2各组大鼠足跖水肿的比较在致炎20d可见模型组大鼠足跖肿胀明显,与正常组比较有显著差异,在致炎40d时,模型组大鼠足跖肿胀因其炎症反应已从急性期过度至慢性期虽呈降低趋势,但其足跖厚度仍然远远高于正常组,且降低幅度不如激素组明显,模型组与激素组有统计学差异。2.3足无血清胞模型可见正常组大鼠在整个实验过程中足爪无肿胀表现,而模型组大鼠在致炎20d出现明显的足爪红肿现象(包括足背侧、足跖侧),致炎40d模型组大鼠足爪无法完全展开,肿胀较前减轻,但关节畸形明显。致炎40d激素组大鼠足爪肿胀较前明显减轻。2.4足跖部组织水肿正常组大鼠足爪无异常,未见骨质破坏表现,而模型组大鼠致炎20d可见双侧足爪软组织肿胀阴影,在双侧足爪足跖部可见骨质破坏碎裂,在致炎40d,模型组大鼠可见双侧足爪软组织肿胀阴影,但肿胀较前减轻,足跖部可见骨质破坏碎裂(其中圆形图案所示部位为骨质破坏部位)。激素组几乎未见足跖部骨质破坏碎裂。2.5各组大鼠血清tnf-含量的比较致炎后40d(即用药20d后)可见模型组血清TNF-α含量显著高于正常及激素组,说明在模型成立后用激素干预CIA大鼠20d,可有效降低CIA大鼠血清TNF-α含量。2.6tnf-表达可见模型组膝关节滑膜中TNF-α表达相对于正常、激素组增强。而激素组TNF-α表达明显低于模型组。说明激素应用后可有效降低膝关节滑膜中TNF-α表达量。3ra的模型构成本研究选取牛Ⅱ型胶原和不完全氟氏佐剂制作类风湿性关节炎的CIA大鼠模型。牛Ⅱ型胶原作用于大鼠,模拟了人类风湿性关节炎的细胞自身免疫过程。牛Ⅱ型胶原刺激大鼠的免疫细胞产生免疫应答,随后产生抗体,识别并结合牛Ⅱ型胶原形成免疫复合体,导致关节、软骨和滑膜的损害。目前国内外关于CIA大鼠模型制作的文献,因选用何种胶原、胶原用量、选取致炎部位,是否加强注射方面不统一,制作的方法很多,但在前期的预试根据某些文献制作CIA大鼠模型,虽CIA大鼠足跖肿胀是有所体现的,但未能发现CIA大鼠明显的骨骼和关节的改变,故实验者认为仅凭足跖肿胀,不能充分说明CIA大鼠模型成立,因为类风湿性关节炎不能仅凭大鼠炎症表现如肿胀则认为成功模拟了该疾病。实验者最终选用了每只大鼠注射等量的牛Ⅱ型胶原和不完全氟氏佐剂乳化剂0.4ml(含胶原400μg),同样方法在致炎14d加强注射乳化剂0.1ml(含胶原100μg)。第一次于大鼠足跖部皮下注射牛Ⅱ型胶原和不完全氟氏佐剂的乳化剂致炎,注射的足跖当日就出现红肿的表现,然后逐渐加重,并向对侧蔓延,在第一次致炎后的14d,进行加强注射,肿胀较前加重,并于致炎20d达高峰,测其足跖厚度平均可达0.65cm左右(为了说明RA的发病机制是一全身免疫反应,而且实验中也看到了不仅是致炎部位的足跖肿胀,其对侧足亦发生肿胀,故特地设计测量未致炎足即左足的足跖厚度),进一步拍摄各组大鼠足爪肿胀的照片,结合足爪X-ray照射,得出在致炎20d,模型组出现了明显的炎症表现,且出现骨质破坏后关节和软骨的较明显改变,如关节畸形和限制行步态的表现,可说明在致炎20d即可成模。证明成模的当日激素组即开始采用激素干预,并且连用20d,每两日1次灌胃给药,激素组大鼠直至致炎40d(即用激素的20d),大鼠的足肿胀度、足跖厚度相对于模型组有明显改善,限制性步态消失,结合足爪X-ray检测,发现激素显著改善类风湿性关节炎大鼠的骨质破坏并能逆转关节软骨损害,同时亦说明致炎20d时采用激素药物干预,连用20d作为一个疗程,是能够逆转类风湿性关节炎损害的。在实验中经过重复3次该种造模方法,可明确此种造模方法及选择用药时机的方案是比较稳定的,重复性较好的。目前常用的判断RA模型成立的方法如足跖厚度的测量,实验者所测的足跖厚度与国内外很多文献是吻合的。在证明成模时不仅选用测其足跖肿胀度,且为观察骨质破坏、关节畸形,需结合其大体图片及足爪X-ray检测,实验者选用三个方面:1)足跖厚度,2)足爪大体图片,3)足爪X-ray检测来证明模型成立。而且相对某些文献的报道来看,在较短的时间内建立了CIA大鼠模型,选择了一个较佳的注射部位方便操作,且成模率较高(在实验中用该方法建模,几乎所有的大鼠都观察到了足跖肿胀,且几乎均在X-ray下发现了足跖部的骨质破坏与关节改变,而且未见大鼠死亡,可认为成模率达95%左右)。并联系RA作为一种炎症性的自身免疫性疾病,检测了血清中的TNF-α和膝关节滑膜中的TNF-α表达情况,观察致炎40d(即用药20d)后的疗效,发现激素能显著降低CIA大鼠血清中TNF-α含量,与模型组有显著差异,同时亦发现膝关节滑膜中TNF-α表达减少。这进一步说明了如何建模、怎样证明、选择什么时机给药、用药多长时间可显著干预或逆转类风湿性关节炎的病理改变。综上所述,实验者采用的这种造模方法,操作较简单,重复性较好,而且缩短了造模时间,并采用有效的指标证明其模型成立后,再用激素进行干预治疗,可有效的逆转类风湿性关节炎的症状,可用于类风湿性关节炎的相关研究,也可为在此基础上制定类风湿性关节炎研究策略奠定一定的基础。1.1药品、试剂标准醋酸地塞米松片,浙江仙琚制药股份有限公司,批号:国药准字H33020822,规格:0.75mg×100片,成人剂量为一次0.75~3.00mg,配制溶液浓度为0.75mg/ml。1.2湖南实验动物中心提供Wistar大鼠30只,雄性,体重(150±20g),由湖南实验动物中心提供(动物合格证号:SCXK(湘)2009-0012)。级别:SPF级,饲养于普通实验室。1.3案例1:美国chndx公司牛Ⅱ型胶原,批号:20021,购自美国Chondrex公司;不完全佛氏佐剂,批号:7002,购自美国Chondrex公司;TNF-αELISA试剂盒,批号:E02T0008,购自上海兰基公司;RabbitAnti-TumorNecrosisα,批号:BA0131,购自武汉博士德公司;两步法免疫组化试剂盒,批号:SV-0001,购自武汉博士德公司。1.4ek自动酶标计数仪和yd-33病理切片机CX40-32J02生物显微分析成像仪(日本Olympus公司);EIX808IUbiotek自动酶标读数仪(美国biotek公司);YD-335病理切片机(浙江益迪公司);KD-BM生物组织包埋机(浙江金华科迪仪器公司);F52-8C500X光机(德国西门子公司);W380数码相机(日本SONY公司);Wi448游标卡尺(北京东西仪科技有限公司)。1.5方法参照文献1.5.1足以的厚度参照文献方法1.5.2各组大鼠足跖侧和足背侧照片比较用相机在致炎20d,分别对正常组与模型组大鼠足跖侧与足背侧拍照,致炎40d再用相机对正常组、模型组、激素组大鼠足跖侧与足背侧拍照。1.5.3足鳞x-现代检测于致炎20d,致炎40d,分别对正常组与模型组大鼠足爪进行X-ray检测,电压51kv,电流8mAs。致炎40d再对正常组、模型组、激素组大鼠足爪进行X-ray检测,电压、电流不变。1.5.4血清tnf-a含量检测正常组、模型组、激素组大鼠在致炎40d股静脉取血,3000rpm离心,取上清,-20℃保存,ELISA方法测定血清TNF-α含量,具体操作按试剂盒说明进行。1.5.5免疫组化检测膝关节滑膜组织正常组、模型组、激素组大鼠在致炎40d取膝关节滑膜组织,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,切片,进行免疫组化检测,具体操作按试剂盒说明进行。显微镜观察并摄片。2.1各组大鼠足跖水肿、tnf-变化在致炎当天注射胶原的足跖即有肿胀,次日后逐渐加强,且于致炎4d蔓延至对侧足跖,双侧足跖肿胀明显约在致炎9d,且致炎大鼠出现明显的关节畸形,限制性步态等,然后逐渐消退,于致炎14d进行加强注射,致炎大鼠肿胀较前期典型,双侧足跖肿胀皆明显,关节畸形较前明显,限制性步态加强,于致炎20d达高峰。用药物干预后肿胀减轻,模型组肿胀也渐渐减轻,但减轻的程度不如激素组,同时足爪畸形依然典型,