拉曼光谱多组分定量分析方法学验证研究

拉曼光谱多组分定量分析方法学验证研究

组成成分的定量分析拉曼光谱技术是近年来发展迅速的在线分析和过程分析技术。光谱范围约为0.4000cm。在含有多种组分的化学体系中,其样品多含多种化学成分,而目标成分有时为低含量组分,故实际采集的光谱数据常常是样品中的各成分数据、各成分之间的互相作用和光谱仪的影响(检测器噪声、环境影响)等的综合数据的加和,很难采用传统方法以单波长或多个波长处方法进行定量,通常采用化学计量学的方法建立数学模型进行定量分析。拉曼光谱在中国药典2010版二部中第一次被收录于“附录XIXL拉曼光谱法指导原则”中,但该原则对拉曼多组分定量分析的方法学验证未作论述,在文献资料中研究亦不多。本工作拟对多组分复杂体系中采用拉曼数学模型定量分析时,进行初步的方法学探索和研究,以对所建立的数学模型进行验证和评价。1实验部分1.1检测仪器和药物MetageOpal便携式拉曼光谱仪(MetageOPALPortableRamanSystem,型号:ProRomanL-785,EVWAVEOptronics.Inc),半导体致冷的CCD检测器,随机配套光纤传输检测探头,eFTIR光谱采集软件(EssentialFTIRV3.00.047fromOperantLLCLicensedtoMTG);OPUS软件(OPUS6.5,德国布鲁克公司);德国赛多利斯BS-124S型分析天平(万分之一);德国赛多利斯BT-25S型分析天平(十万分之一)。羟乙基淀粉注射液(山东华鲁制药有限公司);聚明胶肽注射液(武汉华龙生物制药有限公司);葡萄糖(分析纯,广东省光华科技股份有限公司);纯净水,其余试剂为分析纯。1.2样品及干扰成分的筛选为方便分析研究,实验的研究对象为成分含量相对固定的多组分样品:以多组分样品中葡萄糖含量分析为研究对象,干扰成分主要有水、淀粉(羟乙基淀粉注射液)和蛋白质(聚明胶肽注射液),分别以上述两种注射液配制浓度梯度差为0.1mg·mL1.3数学模型建模和检测系统硬件成拉曼谱图采集采用eFTIR光谱采集软件,数据处理和数学模型建模采用OPUS工作站,随机配套光纤传输检测探头。测定范围3200~100cm2结果与讨论2.1波数准确度和精度测试开机测试样品前须对仪器进行自检,以保证仪器处于良好的工作状态;一般仪器自检应进行波数(或波长)准确度和波数(波长)精度测试,此外还可进行信噪比(或噪音)、(光源)能量测试等。本实验中采用环己烷进行仪器自检,波数准确度和精度测试结果如表3。由表3可知仪器自检时在多个峰位处其波数准确度和精度偏差不大于1.0%。2.2曼曼回归模型分析值与保正比关系在拉曼数学模型中,线性考察采用模型分析值与参考值间的正比关系,理论上模型分析值应无限接近或等于参考值,故拉曼数学模型的理论线性关系为:y=x,R2.3定量限的确定在拉曼光谱中,由于样品测定是通过采用化学计量学方法建立的数学模型进行分析,无法通过光谱本身的信噪比确定定量限。参考定量限(S/N=10)的确定方法和图1—图2中线性定量下限,实验中以样品测定相对误差10%的样品浓度为定量限,故淀粉组和蛋白质组的拉曼数学模型的定量限依次分别为0.6072和0.6083mg·mL2.4高/中/低浓度样品的拉伸数学模型准确度指拉曼数学模型分析值与真实值或参考值相接近的程度,一般用回收率(%)表示,在化学计量学中拉曼数学分析模型准确度的评价一般用所建模型对未知样品(即验证集)的预测能力表示,此外还可用统计方法对数学模型对验证集的分析结果进行统计检验。(1)回收率:可采用的方法有(1)采用已知准确含量的对照品或自制供试品(高/中/低浓度样品各3份)采用拉曼数学模型对回收率样品进行分析,并计算回收率;(2)在供试品中定量加入已知量的对照品,制成高/中/低浓度样品各3份,采用拉曼数学模型进行分析,并计算回收率;(3)将拉曼数学模型对高/中/低浓度各3份样品的分析结果,与经典分析方法测结果比较,并计算回收率。一般情况下,高、中、低各浓度检样品的回收率应在90.0%~110.0%,相对标准偏差(RSD)应小于8.0%。本工作采用方法(1):精密量取葡萄糖适量,分别加相应溶剂溶解并稀释至相应浓度,作为低、中、高浓度样品。分别取各样品,采集拉曼图谱,用所建的模型对各回收率样品进行分析,并计算回收率,淀粉组和蛋白质组样品的拉曼数学模型的平均回收率依次分别为101.6%(RSD=3.24%,n=9)和100.7%(RSD=3.02%,n=9)(2)化学计量学参数:在化学计量学中,拉曼数学模型的准确度和预测能力一般用未纳入建立数学模型的一组样品(即验证集)的模型评价参数如相关系数(correlationcoefficients,R(1)相关系数:表示评价验证集样本的分析值和建模参考值之间的相关程度,相关系数R(2)外部验证均方差:又名预测误差均方根,用于考察和评价所建数学模型对验证集样本整体误差。通常,RMSEP越小表示分析值与参考值之间的方差越小,故所建模型对未知样本的预测效果越好。(3)统计学检验:对验证集样品的分析值和参考值进行方差分析,并进一步采用双侧t检验2.5检测方法和模型(1)重复性:取高/中/低浓度样品重复采集拉曼光谱图,各浓度样品重复采集3次谱图,用所建的数学模型对各图谱样品进行分析,淀粉组和蛋白质组样品的重复性(RSD)依次分别为1.80%(n=9)和2.09%(n=9)(2)日内/日间精密度:取高/中/低浓度样品于当日和次日分别采集拉曼光谱图,用所建的数学模型对各图谱样品进行分析,考察日内精密度和日间精密度淀粉组和蛋白质组样品的日内和日间精密度(RSD)均小于4.0%2.6实验验证及结果由于拉曼光谱定量数学模型所针对的分析对象即为复杂成分样品,无须像传统方法提供空白样品和进行破坏实验等验证对目标成分的含量测定无干扰,故本研究中未进行专属性研究。另外实验中应考察可能对数学模型分析测定时的干扰因素,典型的变动因素如温度、湿度等,并根据干扰因素对数学模型分析测定结果的干扰大小,制定拉曼数学模型的具体测定要求和适用范围。3拉曼光谱方法学验证由于拉曼光谱法定量分析属于二次方法开发,其是以对第一次定量方法所得值为参考值,采用化学计量学的方法建立数学模型进行快速含量分析,目前学者多关注数据处理方法或定量方法的研究和开发。拉曼光谱方法学验证在药典和文献