度人教版DNA的粗提取与鉴定 市赛获奖

1.1DNA的粗提取与鉴定专题五DNA和蛋白质技术1.知识目标理解DNA的理化特性及根据其理化特性而提取和鉴定的原理。2.能力目标(1)初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法。(2)在对实验原理、步骤的理解和分析过程中发展学生的科学思维。3.情感、态度、价值观在科学实验过程中培养学生严谨比较细致、实事求是的科学态度。学习目标

一、导入新课这节课,我们一起学习“DNA的粗提取与鉴定”技术。板书:DNA的粗提取与鉴定DNA的提取技术是整个基因工程技术基础。基本上,不论是出于何种目的的分子生物学实验,大到被称为“人类阿波罗计划”的人类基因组计划,小到今天已经被我们熟知的亲子鉴定,DNA提取技术都是其中基础的基础。而其他诸如RNA的提取,质粒的提取等实验,都可以说是参考这一技术改进,或者重新设计出来的。

1、选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言．就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。二、提取原理DNA的粗提取与鉴定2．原理、方法和目的基本原理方法目的DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，在0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低溶于NaCl溶液中并稀释①NaCl溶液为2mol/L时，DNA溶解，而部分蛋白质发生盐析生成沉淀，通过过滤可除去部分蛋白质及不溶于NaCl溶液的杂质②当NaCl溶液稀释至0.14mol/L时，DNA析出，过滤可除去溶于NaCl溶液的部分蛋白质和其他杂质DNA不被蛋白酶所水解加入嫩肉粉嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，水解蛋白质（酶的专一性）DNA不溶于酒精溶液加入冷却酒精(95%)DNA析出，除去溶于酒精的蛋白质DNA可被二苯胺染成蓝色加入二苯胺，并沸水浴鉴定DNA高温DNA耐高温DNA和蛋白质对高温耐受性不同：蛋白质、DNA热稳定性不同。大多数蛋白质不能忍受60～80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。DNA对洗涤剂耐受性洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。加入洗涤剂51）不同浓度NaCl中DNA溶解度不同。

2）DNA与其他细胞成分在酒精中溶解度不同，DNA不溶于酒精，细胞中某些蛋白质则溶于酒精。3）DNA和蛋白质对酶耐受性不同：酶的专一性——蛋白酶水解蛋白质。但是对DNA没有影响。4）DNA和蛋白质对高温耐受性不同：蛋白质、DNA热稳定性不同。大多数蛋白质不能忍受60～80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。5）DNA和蛋白质对洗涤剂耐受性不同：洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。提取DNA的原理包括DNA的

两个方面溶解性和耐受性3.DNA的粗提取实验原理64.实验材料

①动物

鸡血细胞液的优点提醒：人和哺乳动物成熟的红细胞中不含细胞核，也没有DNA，不适于作为DNA提取的材料，但却是提取血红蛋白的理想材料。

鸡血红细胞、白细胞中都有细胞核，含大量的DNA,既经济又易取

②植物：新鲜菜花、蒜黄、菠菜等。

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DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。二、DNA的溶解性溶解度NaCl浓度0.14mol/L曲线解读：1、在NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；2、在0.14mol/L时，DNA溶解度最小；3、当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。

利用该特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。

DNA不溶于酒精，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步地分离。

粗提取提纯

与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。

本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因：一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。为什么用鸡血细胞做实验材料？能否选用牛、羊、马血做实验材料？为什么？不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核，仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数DNA，在实验中很难提取到。三、以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取1、制备鸡血细胞液2、破碎细胞，释放DNA3、溶解细胞核内的DNA4、DNA的析出——提取5、DNA的初步纯化——提纯6、DNA的鉴定提取DNA的具体步骤1、制备鸡血细胞液

取质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液100mL，置于500

mL烧杯中，注入新鲜的鸡血（约180mL），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免血液凝结。将烧杯中的血液置于冰箱内，静置1d，使血细胞自行沉淀。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。

柠檬酸钠可防止血液凝固2、破碎细胞，释放DNA

向鸡血细胞液中加入蒸馏水，并且搅拌，从而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加速细胞的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。

释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用3～4层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。

蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？

可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。3、溶解细胞核内的DNA

在浓度较高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游离出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入两倍体积的浓度为2mol/L的NaCl溶液，搅拌1min。注意应沿一个方向搅拌，使DNA充分溶解。如果使用植物材料，必须研磨充分。

研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。4、DNA的析出——提取

将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。

加蒸馏水降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。

实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的始终浓度为0.1～0.2

mol/L。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？

1、用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；

2、用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。5、DNA的初步纯化——提纯

如果提取的DNA量不够多且其中含有较多杂质，或者加入溶液和搅拌等操作过程不规范，都会导致实验现象不明显，常常使制取的DNA粗制品不能显示出DNA的本色──白色。为了增进实验效果，需要对DNA粗制品进行简单的提纯。6、DNA的鉴定

二苯胺法：紫外灯照射法：

用蒸馏水配制质量分数为0.05%的溴化乙锭(EB)溶液，将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹到蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯(260nm)下照射(暗室中)，可呈现橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在260nm处)。电泳法：适合鉴定纯度较高的DNA。DNA与二苯胺沸水浴呈现蓝色。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。

提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。提取DNA的实验操作主要步骤的目的⑴过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液目的:获得含核物质的滤液

⑵过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液目的:获取纱布上的粘稠物

⑶过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液目的:得到含DNA的滤液

本实验中有三次过滤,分别有什么作用?第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液

加速细胞的破裂第二次搅拌加2mol/LNaCl溶液的滤液

使DNA与溶液混合均匀第三次搅拌加蒸馏水至0.14mol/LNaCl溶液

稀释NaCl溶液,析出DNA第四次搅拌放入2mol/LNaCl溶液中纱布上的粘稠物

使DNA尽可能多的溶于溶液中第五次搅拌体积分数为95%的酒精

提取含杂质较少的DNA实验中有五次用玻璃棒搅拌?分别有什么作用?DNA的粗提取与鉴定实验原理DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同DNA与其他细胞成分在酒精中溶解度不同DNA和蛋白质对酶、高温和洗涤剂耐受性不同DNA与二苯胺呈现蓝色反应DNA粗提取选择适宜材料破碎细胞DNA的溶解和析出DNA的纯化鉴定DNA与二苯胺混合，沸水浴，呈现蓝色反应课堂总结：1、下列图示中能反映DNA溶解度与NaCl溶液浓度(mol/L)之间的关系的是（）C0.14DNA溶解度0.140.140.14DNA溶解度DNA溶解度DNA溶解度ABCDNaCl浓度NaCl浓度NaCl浓度NaCl浓度25课堂练习：2、下列操作可以达到目的的选项是选项操作目的A溶解海藻酸钠时用大火加热海藻酸钠可以快速溶解

B将装有蛋白质粗制品的透析袋（玻璃纸制成）放入透析液中

蛋白质与其他小分子化合物分离C在DNA粗提取实验中，鸡血中加入蒸馏水稀释血液，防止凝固D洋葱根尖解离后漂洗使细胞分散，利于观察B微火加热并不断搅拌，