免疫组化组织细胞的取材、固定、切片操作方法及要点

免疫组化组织细胞的取材从大体标本上切除适量的组织材料进行研究就是取材。取材不仅在免疫组化而且在常规病理检查中也十分重要。用于免疫组化的组织一般取材大小为1.OcmXI.OcmXO.2cra。取材时应剔除脂肪和钙化，否则会影响切片，出现假阳性或假阴性结果。组织标本包括动物标本、手术活检标本、尸体解剖标本及细胞标本等，有关各种标本的取材方法分述如下。一、动物的致死法及取材致死法空气栓塞法向动物静脉内注入一定量的空气，使动物很快死亡。一般适用大动物，例如兔、犬、猫等动物。⑵麻醉法可将浸有乙醚或氯仿(三氯甲烷)的棉球连同动物一起放人密闭容器内进行麻醉，也可用4%戊巴比妥作静脉注射或用20%氨基甲酸乙酯做腹腔注射。适用于鼠等小动物。⑶断头法用剪刀剪去动物的头部，待血液流出后立即取材。适用于小动物。去头法用重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。股动脉放血法动物麻醉后，切开股动脉放血致死。取材注意事项最好在动物心脏还在跳动时立即取材，并迅速投入环保组织固定液内。脏器的上皮组织易变质，争取在死后半小时内取材完毕，否则免疫组化染色时会产生背景染色。切取组织使用的刀、剪要求锋利，避免来回挫动组织。因动物组织质脆，因此夹取组织时切勿用力过重，以免挤压损伤组织。二、尸体解剖的取材尸体解剖的取材应根据实际需要进行，一般取材部位和数量如下。心和大血管右心室一块左心室一块主动脉一块取材部位可在距主动脉瓣5cm处。肺右下叶一块，切成正方形；左下叶一块，可切成长方形。肝右叶一块，切成正方形；左叶一块，切成长方形。⑶脾一块。⑷胰一块。肾两肾各一块，包括皮质、髓质和肾盂。右肾一块切成正方形，左肾一块切成长膀胱一块。肾上腺左、右各取一块。消化道食管一块，胃窦部一块，小肠一块，淋巴结一块，直肠一块。骨脊椎骨一块。胸腺一块。子宫宫颈和宫体数块。睾丸或卵巢各一块。脑左侧运动区一块，左侧豆状核一块，小脑一块。脑下垂体一块，前叶或包括前后叶。如有较严重或复杂病变时应适当增加取材数量，以便彻底检查而作出正确诊断。三、活检标本的取材(一)常规活检标本的取材应注意病变的部位、形状、大小、颜色以及与周围组织的界限，有无完整的包膜。取材时应取病变部位、病变的切缘、病变与正常组织交界处以及远离病灶的正常组织。取材用的刀剪应锋利，避免挤压组织；组织的切面应平整，组织切忌过大、过厚，否则不仅浪费试剂，而且会造成固定、脱水不良而影响镜下观察。（二）肾穿剌标本的取材进行穿刺取得组织后，立即用生理盐水或PBS冲洗数次去除血迹，并迅速判断所穿组织是否为肾组织（肾组织应为暗红色）。当确定为肾组织后，立即将组织置于木板上，迅速测量其长度；用解剖显微镜或放大镜进行观察，以区别皮质和髓质，并观察标本是否有肾小球。在解剖显微镜下，肾皮质较淡，皮质区可见一些分布不规则、朦胧的红色小点，此即为肾小球。使用解咅0显微镜可帮助区别组织，作出准确的判断，使肾活检可靠。穿刺所取得的标本用手术刀片切开/并迅速固定，一半放人装有光镜固定液的青霉素小瓶内’另一半放人装有电镜固定液的小瓶内，均置于冰瓶内保存。㈢斶本的活检取材小标本常见为宫颈、宫内膜、鼻咽、口腔、喉以及各种内窥镜所取得的组织。它们体积较小，因此取材时要用擦镜纸包起来再进行固定、脱水，寺别是由胃镜、肠镜等所取的组织，取材时一定要滴上伊红，以防止丢失。活检组织多用活检钳夹取，常因过度挤压而变形。病灶表面有出血坏死，活检时难于采取到深部组织。因此，活检钳的刀口必须锋利，活检时必须采取主要病灶区，尽量避开坏死区。免疫组化组织细胞的固定凡需进行病理研究的标本均需进行固定。将组织置于某些化学试剂中，使细胞内的物质免疫组织化学实验技术及应用尽量接近于其生活状态时的形态结构和位置称为固定。而用于免疫组化研究标本的固定不仅是使细胞内的蛋白质凝固终止或减少外源性和内源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，更重要的是保存组织或细胞内的抗原性，吏抗原不失活，不发生弥散。不同的抗原，其抗原稳定性不同，衣抗原耐受固定液的程度可分为：①不稳定性抗原，如T淋巴细胞表面抗原属此类抗原，一般以冰冻切片进行免疫组化染色；②半稳定性抗原，如B淋巴细胞的胞浆免疫球蛋白等；③较稳定抗原，例如HBsAg、HBcAg、AFP、CEA、S—100、Keratin和部分多肽类激素等，其抗原性受固定剂种类、固定时间、温度等影响不大。固定剂的种类很多，性能不一，因此固定不同的组织应选择合适的固定剂，寺别是标记半稳定抗原时，更要选择合适的固定剂和固定条件。一、固定液的种类较好的固定液应具有强渗透力，能迅速渗入至组织内部；其次不会使组织发生过度收缩变形，并能使组织内易观察的成分得以凝固为不溶性物质；还要使组织达到一定硬度，有较好的折光率。固定液分为简单固定液和混合固定液。因目前大多数固定液都是有毒有机溶剂组成，欧美国家已不再使用，基本由环保组织固定液替代。西奈山环保组织固定液由植物多糖、乙醇、醋组成，固定效果明显优于常规甲醛。二固定的方法1．浸泡法这是最常用的固定法，将取好的组织直接浸泡在固定液中，固定的时间一般在2-24h它适用于动物标本、尸检标本及临床活检标本等。.蒸气法比较小而薄的标本可用锇酸或甲醛蒸气固定。主要用于血液、细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。具体方法：在一有盖培养皿内滴人1%—2%锇酸水溶液3滴，将涂片放人其中，固定30s至Imin左右，立即水洗后进行染色。3•注射、灌注固定法主要适用于动物实验标本的固定。将固定液注入血管，以达到充分的固定。经血管分支到达整个组织或全身局部灌注固定固定肺组织可将固定液从气管或支气管注入，注入速度不要太快，用力均匀，注入量适当，以免胀破肺泡。固定眼球组织可从眼后房注人固定液。固定肝、肾组织则可从肝、肾动脉注入固定液，同时切断其静脉使得血液排出。脑组织的固定，必须先麻醉动物，分离颈动脉，注射器的针尖向着头部的方向注入固定液。全身灌注固定较大的动物往往采取输液方法，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，将另一侧相应的静脉切开放血。固定液的输入量因动物而异，兔、猫约500~1000ml,猴、狗约1000—2000mI。微波固定法近几年来微波固定法一直可见报道。经微波固定的组织具有收缩较小、核膜清晰、染色质均匀、分辨清晰等特点，但必须严格控制微波固定的时间和温度。免疫组化组织细胞的脱水(一)概述组织经固定和水洗后，会有大量的水分留在组织中，而水又不能与苯融合，因此必须在透明前脱去组织中的水分。用某些溶剂将组织中的水分置换出来的过程称为脱水。对于不同的组织应分开脱水，特别是一些易脆的组织(如肝、脾等)应严格掌握脱水时间，防止在无水酒精中停留时间过长。对于动物组织，应比人体标本相应缩短脱水时间。脱水应按照从低浓度到高浓度的过程，否则标本直接进入高浓度溶液中极易引起组织的强烈收缩或使组织发生变形，从而影响切片，还会造成免疫组化实验过程中的脱片。(二)脱水剂的种类乙醇最常用的脱水剂，脱水能力强，并能使组织硬化，与二甲苯能混合。其缺点是在高浓度乙醇，特别是无水乙醇中停留时间长会引起组织收缩、变脆而影响后续的切片。尤其是应用全自动脱水机，因是加压抽真空并加温脱水，在高浓度乙醇中停留时间更不能太长，应经试验摸索出适合自己单位脱水需要的时间，不能盲目从书本上套用脱水时间。脱水时，应从低浓度向高浓度梯度进行。一般是人体组织从？5%乙醇开始，对于小动物、胚胎及柔软的组织可从30%乙醇开始脱水。只有脱水充分，才能在透明剂中透明。若是人工脱水，必须在加盖的容器内进行，尤其是高浓度乙醇很易吸收空气中的水分朋雨天更应注意。在透明前最好将组织取出，用滤纸吸干后再透明。丙酮脱水作用比乙醇强，但对组织的收缩也大，毒性强，价格高，因此一般不用于常规组织的脱水，主要用于快速脱水及固定兼脱水。此时应注意个人防护，最好在带有抽风功能的装置中进行，脱水时间1~3h左右。丙酮还可作为染色后的脱水剂，用于甲基绿一派洛宁显示DNA及RNA。正丁醇为五色液体，微溶于水，在100ml水中只能溶解8.3g，故脱水能力较弱，但能与水、乙醇及石蜡混合，因此经正丁醇脱水的组织可直接浸蜡。它的优点是很少引起组织的收缩及变脆。一般用法为：组织经固定及冲洗后，依次人50%、70%、80%乙醇中脱水，然后人正丁醇，12~24h后浸蜡。使用时也应注意防护。⑷叔丁醇异丁醇的一种，可与水、乙醇、二甲苯混合，可以单用或与乙醇混合使用，是一种使用较广的脱水剂，它不会使组织收缩或变硬，不必经过透明而直接浸蜡。电镜上为常用的中间脱水剂。⑸环己酮沸点为140〜C,冰点为一40〜C,密度与水相似，无毒，可与苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂混合，也是石蜡溶剂，可代替纯乙醇脱水后直接浸蜡，组织不会变硬，不需经二甲苯透明。⑹松脂醇组织固定后按常规经各浓度乙醇至95%乙醇中，按下列顺序进行脱水和透明处理：浸入等份95%乙醇和松脂醇的混合液中，待组织块下沉后转入下步处理；95%乙醇1份加松脂醇2份的混合液中浸泡1h；95%乙醇1份加松脂醇3份的混合液中浸泡1h；松脂醇I、口、皿中各浸泡1h:⑤松脂醇5份加石蜡1份的混合液中浸泡lh，然后浸蜡包埋。多用于经乙醇或Carnoy液固定的组织。经松脂醇处理的组织收缩较小，发生硬化也少。中性缓冲福尔马林影响HE染色用中性缓冲福尔马林后，细胞核颜色的确不够鲜艳，可在染苏木素前用3%冰醋酸媒染10分钟，会有所改善。免疫组化组织细胞的固定（续）三、固定的注意事项固定液的量固定组织时，必须有足够的固定液，一般为组织块体积的10~15倍。固定用的容器必须足够大，组织材料不要太多，避免组织中的水分渗出而影响固定液的浓度。2•固定的组织必须新鲜组织取材后应立即固定，否则，组织易收缩变形，并发生自溶现象。3•组织块的体积组织块的体积宜小而薄，一般用于免疫组化的组织大小宜为1.OcmXI.OcmX0.2cm。组织太大，内部得不到充分固定，导致组织结构破坏，给切片带来一定的困难，还增加非特异染色，同时浪费试剂。4.组织固定后的冲洗组织固定后，因固定液渗到组织中，所以必须彻底冲洗，除去固定液，否则会影响下一步的脱水。特别对于长时间固定的标本应用流水冲洗，尽可能减少色素沉着。对于混合固定液固定的组织，更要及时冲洗，否则将影响免疫组化切片的质量。四、影响固定的因素温度一般固定液固定效果随温度升高而加强，温度一般在-70~37弋之间，？以室温22弋常用。某些酶的固定要求在37弋以下进行，而某些病毒的固定则要在低温下进行，如用丙酮在-20一-40弋之间固定30min最佳。对于临床活检标本，固定时间要求短，实践发现用中性甲醛在40°C左右固定2~3h即可。2•浓度10%中性甲醛、4%多聚甲醛最合适，乙醇最常用浓度为95延。在37C或室温固定，适合于许多蛋白质、抗原，并能保持其与抗体的反应能力。70%的乙醇固定能力最强。•固定时间固定时间要视组织块的大小及固定液的种类、浓度、温度而定。组织块越大，固定时间越长;反之，组织块越小，固定时间越短。固定液的穿透力与浓度成正比，固定的时间与温度成反比。总之，固定的时间应根据条件而定。没有任何一种固定液适合于所有组织的固定，应根据条件选择合适的固定液，可以用多种固定液固定作对比，找到比较切合本单位实际的固定液。免疫组化组织细胞的透明（一）组织透明的目的及注意事项组织经某些化学试剂作用后，呈现不同程度的透明状态称为透明。组织透明的目的是便于浸蜡包埋，因为很多脱水剂不能与石蜡混合，必须通过透明剂的作用才能使石蜡浸入组织中，因此透明剂必须既能与脱水剂混合，又能与石蜡混合。如果组织透明不彻底，就会导致浸蜡不良。组织透明不彻底的原因主要是固定、脱水不良以及透明剂的纯度不够造成的。透明剂的体积应为组织体积的5~10倍，并注意定期更换。应用全自动脱水机、标本量又较大的单位，应争取每星期更换一次透明剂；标本量小、用人工脱水的单位，在脱水结束后，可以将组织块取出，用滤纸吸除组织中多余的脱水剂，再放人透明剂中，并观察组织是否透明而决定是否应更换透明剂。（二）常用透明剂的种类(1)因透明剂大多有强毒性和刺激，欧美主要国家目前都已改用环保透明剂，逐步禁止使用二甲苯类有毒透明剂。西奈山环保组织透明剂系水果油调配而成，纯天然，无毒有水果香味，透明效果好，正逐渐在各大医院推广使用。(2)二甲苯为最常用的透明剂，毒性刺激性大、易挥发，不溶于水，透明力强，易使组织收缩、质脆，故组织在二甲苯中停留时间不能太长，特别是动物组织更应严格掌握透明时间。二甲苯在用于染色后的透明时，组织应先浸于二甲苯和苯酚混合液3:1)后，再进入二甲苯透明。⑶甲苯和苯性质与二甲苯相似，但透明速度较慢，对组织的收缩程度小。氯仿毒性大、不易使组织变脆，其透明能力较二甲苯差，因此透明时间相对较长，易挥发，多用于大块组织的透明。香柏油剧毒、是一种柏树树脂，能溶于乙醇，是乙醇脱水后的良好透明剂，但透明时间长达24h。⑹苯甲酸甲酯有毒难溶于水，溶于醚，折光率1•517。经95%乙醇脱水后的组织可直接进入苯甲酸甲酯透明。也可用于火棉胶切片。(7)苯胺油有毒、又称安尼林油。微溶于水，能与醇、醚、苯以及其他多种有机溶剂混合，应注意避光保存。免疫组化组织细胞的包埋（一）石蜡包埋法石蜡是组织切片技术中应用较广泛的包埋剂切片石蜡须是经多次过滤后呈半透明状的优质石蜡，熔点为56—58〜C的蜡较适宜。包埋时应注意包埋面必须平整，破碎组织应聚集在一起包埋，并注意一些特殊的包埋面。包埋蜡的温度应与组织块温度接近，过高会烫伤组织，过低使组织和石蜡分离,不利于切片。（二）体液包埋法体液标本，如痰液、胃液、尿液、胸腹水等，也可行石蜡包埋。痰液应选用含血液的部分或较为可疑的实体部分，滴上伊红后，用皱纹纸包好，用10%的中性甲苯固定，再经常规脱水、透明、浸蜡并包埋。新鲜的胃液、尿液、胸腹水等体液标本，倒去上层的澄清液体，将下面浑浊的液体放人离心管中，以2000~3000r/min离心15min，倒去上清液后，以环保组织固定液固定下面的沉淀物，然后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。（三）快速石蜡包埋法本法适用于没有冰冻切片设备，进行术中病理诊断的单位，取材时注意应小而且薄。主要过程如下。⑴将组织放人环保组织固定液中⑵人纯丙酮1,3min。⑶人纯丙酮口，3min。（4）人苯，2min。⑸人石蜡，5min。快速包埋后切片、染色封固。冷冻干燥包埋法冷冻干燥包埋法的基本原理是将新鲜组织低温速冻，再利用真空排除组织内所有水分，吏石蜡直接浸入组织内而制成蜡块。其优点是可以保存组织内可溶性物质，防止蛋白质变性和酶失活。基本过程：新鲜组织在液氮中速冻后，真空抽气，以排除组织内的水分，然后将充分干燥的组织用甲醛蒸气固定，再将固定过的组织浸入石蜡内浸蜡，最后石蜡包埋。此法包埋的蜡块可用于免疫荧光和免疫酶标记，也可用于放射自显影及IGSS方法。免疫组化组织浸蜡切片组织经过脱水、透明后置人石蜡中，使组织变硬而利于切片的过程称为浸蜡为了使石蜡完全取代组织中的透明剂，必须经3次浸蜡，每次时间为1h左右。本实验室蜡的熔点一般为56~58〜C,这种熔点的蜡较适中，经过此种石蜡浸透，包埋后切片顺利，连续性好，展片平整。切片是免疫组化准备工作的最后一步，其切片质量相对于常规组织切片来说要求更高，要切得薄而平整，并注意不可有刀痕。主要有石蜡切片、冰冻切片、塑料包埋切片、碳蜡切片等。在切片前还需对载玻片进行相应的处理。一、载玻片的处理免疫组化染色时间长，特别是双PAP、免疫金银染色等方法，所需时间更长，并要反复洗涤，切片在试剂中长时间浸泡，经多次洗涤，极易造成脱片而影响实验的结果。需采用以下方法处理：载玻片先置于洗洁液（或洗衣粉溶液）中煮沸30min，清水洗干净后放人清洁液中浸泡12—24h，漂洗，用蒸馏水清洗后置于烤箱内干燥，然后涂以切片黏合剂。切片黏合剂的配制方法如下。⑴明矶一明胶的配制方法明矶、明胶各1g，加入到100ml1%甘油中，加热至70〜C熔化，并搅拌混合至完全透明状，将切片浸入此液中几分钟，也可以涂在载玻片上，36弋2h后即可使用。（2）合成乳胶一聚醋酸乙烯乳液的配制方法合成乳胶是一种高分子乳化聚合物，具有高度黏合力，无毒、无臭、无腐蚀性。取合成乳胶10份，加蒸馏水90份，搅拌成10%的使用液备用。载玻片可以浸泡此液中，也可以涂片。浸泡时浓度最好稀一点；用于涂片最好浓度高一点，涂完后在36~C中5h后即可使用。（3）多聚赖氨酸0.05%多聚赖氨酸（分子质量200kDa）水溶液，临用时现配，电吹风吹干即可使用。（4）进口切片黏合剂此胶属树脂胶，国外作为木材的黏合剂。涂胶方法同⑴，即直接涂片或浸入涂片。一般买回来的黏合剂需10%稀释。⑸甲醛一明胶1%明胶5mi,2%甲醛5ml,混合即可涂片。⑹明胶一铬明矶一戊二醛黏合剂载玻片在10%Extron中65°C清洗60min,用热水冲洗60min，双重蒸馏水洗2次，空气干燥，然后浸在0.5%明胶一0.05%铬明矶液（注：先将0•5%明胶60~C溶解，冷却后加入铬明矶）中，40~C浸浴lmin,空气干燥，用0。2%戊二醛（PBS酉己制）固定60min,PBS洗后，切片空气干燥，于4~C保存。⑺白胶一多聚赖氨酸混合液一取进口切片黏合剂10ml，加10mg多聚赖氨酸混匀，即可用于涂片。二石蜡切片石蜡切片不仅是常规病理中的重要切片形式，也是免疫组化研究中较常用的切片形式，它能满足免疫组化的连续切片要求。为了便于染色及观察，切片时应注意：①连续切片时应按顺序分离及贴片，不应颠倒；②贴片时应距载玻片一端至少1cm，-般靠一边，以利于显色安全；③用于免疫组织化学染色的蜡温应为56—58弋，切片水温在40弋左右，应先置于冷水中，然后再移人热水中，这样可以使切片能顺利展平；④切片刀要求快，切片要薄，无刀痕和皱褶，在染色时可减少非特异染色；⑤烤片时要注意，抗原性较强的组织可在60弋烤3—8h，抗原较弱的组织可于37弋恒温箱内过夜；⑥切片如需长期保存，可置于4弋或室温下，千万不可脱蜡后4弋保存，因脱蜡后失去了对抗原决定簇的保护。三、冰冻切片冰冻切片的优点是能较完整地保存抗原性。组织细胞的某些抗原成分，特别是细胞膜抗原、受体抗原、酶及肽类抗原在石蜡切片的处理过程中，可不同程度遭受破坏或失去抗原性，而冰冻切片就能最大限度地保护抗原。缺点是在冷冻过程中形态结构可能破坏，抗原易弥散，不能用于常规病检及回顾性研究。如希望保存较长时间和避免抗原弥散，可用环保组织固定液在4度固定5-10min。目前大多采用恒冷箱冰冻切片机，将新鲜组织置于-25弋左右的恒冷箱中，待组织完全冷冻后即可连续切片。其注意事项：①切片刀要快，并且预先冷冻，恒冷箱的温度一般调至-25^左右，不能太低，否则组织表面易出现冰渣；②抗卷板的位置要适中，否则难成片；③贴片时动作轻而迅速，否则易出现皱褶；④组织从液氮内或80弋取出，必须进行温度平衡后才能切成片，切完的组织如下次还用,应用冷冻头在没有完全溶解前取下，密闭后低温保存。切片后，应用电吹风冷风吹干或自然干燥。如在短时间内用，可全部进行固定，固定后，PBS洗，吹干后低温冰箱内保存。四、碳蜡切片碳蜡切片与石蜡切片相似，碳蜡是水溶性蜡，因此切片时不需用水展片，只需贴在载玻片上，吹干即可。切好片应把碳蜡块密闭保存在干燥器内。另外，碳蜡切片不需脱蜡至水，切片可直接入水进行各种染色。免疫组化石蜡切片的脱蜡石蜡切片脱蜡这个步骤，操作时经常被忽视，其实这是很重要的一个步骤，脱蜡是否完全直接影响后面的扌几原扌几体结合。常规是切片放在二甲苯中3-5min，两次，必要时可升高温度，尤其是没有使用低熔点石蜡包埋的切片。因为二甲苯毒性比较大，刺激性特别强，需在通风柜中操作少部分同仁为了尽量缩短接触二甲苯的时间，导致脱蜡不完全。现在国外实验室大多不使用xylene二甲苯这个有毒试剂，而改用环保组织透明液，可在普通实验台上操作，可确保脱蜡完全。很多国外文章漂亮的片子，都是这些细节决定的喔！石蜡切片免疫组化染色步骤1、载玻片的处理：抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001APES、ZLI-9003HistogripTM或ZLI-9005Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：APES:现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20〜30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。HistogripTM:将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。Poly-L-Lysine:将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。2、常用酶消化：2.1胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%〜0.1%，消化时间为37°C、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。2.2胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37C、30〜180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白）,CollagenIV（IV型胶原）等。g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。m皂素（Saponin）:—般使用浓度为2~103、抗原热修复：如果组织固定没有使用甲醛类固定液，使用的是环保组织固定液，如西奈山环保组织固定液，一般情况下，可省去抗原修复过程，因非醛类固定液，不对蛋白形成大量的交联，不会掩盖抗原族。可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064士枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.00.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。3.1石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3%H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟x3o将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92弋〜98弋之间并持续10〜15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）PBS洗，下接免疫组化染色步骤。3.2石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml〜3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5〜6分钟后），计时1〜2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟x3,下接免疫组化染色步骤。3.3石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸从小容器的温度到达92弋〜98°C起开始计时15〜20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗,PBS洗，下接免疫组化染色步骤。4、免疫组化染色步骤：（以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）1）石蜡切片脱蜡至水。2）3%H2O2室温孵育5〜10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，（如需采用抗原修复，可在此步后进行）。4）5〜10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37弋孵育1~2小时或4弋过夜。5）PBS冲洗，5分钟x3次。6）滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37弋孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37弋或室温孵育10〜30分钟。7）PBS冲洗，5分钟x3次。8）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释）,37弋孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37弋或室温孵育10〜30分钟。9）PBS冲洗，5分钟x3次。10）显色剂显色（DAB或AEC）。11）自来水充分冲洗，复染，封片。冰冻切片免疫组化染色步骤室温放置30分钟后，入4弋丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟x3。用3%过氧化氢孵育5〜10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟x2免疫组化实验过程中的要点和技巧1•固定：常用4%的多聚甲醛固定液，最好用环保组织固定液，安全，无毒。对于冰冻切片，环保组织固定液有更好的优越性;但对于不同的组织和抗原/可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。BouinS固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。2•组织脱水，透明：时间不能太长，应用新型环保组织透明液，不含二甲苯等有毒试剂，可避免切片时容易碎片，切不完整。•切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。•烤片：60°C30分钟或37弋过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。•蜡块及切片的保存：最好在4C保存•脱片问题：Poly-L-Lysine侈聚赖氨酸）为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES1:50丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。7•灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。8•暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度（不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书）。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。•封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭•抗体稀释：应遵循"现用现配"的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。11•背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1%。Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。12.返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。13•显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。14•在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。免疫组织化学组织细胞的组织浸蜡组织经过脱水、透明后置人石蜡中，使组织变硬而利于切片的过程称为浸蜡。为了使石蜡完全取代组织中的透明剂，必须经3次浸蜡，每次时间为1h左右。本实验室蜡的熔点一般为56~58〜C,这种熔点的蜡较适中，经过此种石蜡浸透，包埋后切片顺利，连续性好，展片平整免疫组化操作制度1、设置单独的实验室。2、必须有专用的