分子生物学实验报告全解(有图有真相)

图中箭头所示即为本组基因组DNA的PCR电泳图2.P38的PCR图中箭头所示即为本组P38的PCR电泳图六．分析与讨论 这两个PCR扩增实验对熟练掌握PCR的基本实验技能和原理意义重大，通过对所提取的DNA用PCR扩增仪进行扩增，对聚合酶链式反应有一个宏观的认识。本组条带清晰可见，这与科学的实验操作和细心的实验态度密不可分，在做实验的过程中，不断培养自身科学严谨的实验素养，加强实验技能的训练。

实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析一、目的掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。大分子量DNA分子的酶切分析。二、原理十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。在本实验方案中，首先通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液，中层为蛋白质和细胞碎片，下层为氯仿。取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。由于CTAB能溶解于乙醇，在洗涤过程中CTAB即可被除去。三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料小麦幼苗（二）试剂1.DNA抽提液用时将下述三种溶液按1:1:0.4(V/V)比例混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g/L），即为抽提液。①DNAextraction（500ml）：31.885gsorbitol(山梨醇)6.05gTrispH8.2(一般不调)②Nucleilysisbuffer（500ml）:100ml1MTrispH7.5100ml0.25MEDTA200ml5MNaCl10gCTAB100mlddH2O③5%sarkosyl(N-月桂酰肌氨基钠盐)500ml2.氯仿：异戊醇（24：1）370%乙醇4.异丙醇5.HindIII酶6.EcoRⅠ酶（三）器材1.台式离心机2.恒温水浴3.紫外分析仪4.微量加样器四、操作步骤（一）基因组DNA提取1.取0.6g左右小麦叶片，在液氮中研磨后分装到四个1.5ml离心管中，每管加入700μl抽提液（65℃预热）混匀，放入65℃2.取出裂解好的DNA，加入700μl氯仿：异戊醇（24：1），猛烈混匀，离心（10000rpm，10分钟）。3.取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈混匀，使DNA成团，-20℃放置半小时以上。4.将析出的DNA离心，14000rpm，10分钟。5.去掉上清，将沉淀用1ml70%乙醇清洗一次，离心干燥，溶于50μlTE中。酶切及电泳分析1.按照下表加入各成分。管号=1\*GB3①植物基因组DNA/μl10EcoRⅠ/l1EcoRⅠBuffer（10×）2ddH2O/μl737℃反应4h，迅速加入2μlEDTA终2.10000rpm离心20S混匀，37℃3.0.8%琼脂糖凝胶电泳（样品全部点样）。4.观察并记录结果。五、实验结果1、基因组提取电泳图箭头所示即为本组基因组DNA的电泳条带2、基因组DNA酶切电泳图 箭头所示即为本组基因组DNA酶切的电泳图六．分析与讨论根据电泳条带来看，基因组DNA的提取情况良好，但是基因组DNA的酶切条带并不理想。正常情况下，酶切条带应该呈现分子量不同的多条带，但是如图所示，除了离点样孔较近的地方有亮线外，其它地方都没有明显条带，还有拖尾现象。造成这种现象的原因可能有：加入的限制性核酸内切酶量过量；所提取的DNA纯度不高，导致酶切效果不明显；根据图示发现marker条带也不是很好，这可能是电泳中的缓冲液浓度或者是电流大小有问题。可能是所用的DNA酶被污染，或酶切时间过久。注意事项：拿到小麦幼苗，首先进行称量并用剪刀剪碎于研钵中，然后加入液氮进行研磨。待液氮刚刚浸没幼苗时，开始迅速研磨，到液氮挥发干净时立刻停止研磨。操作反复进行，直至幼苗呈现绿中透白的粉末为止，在液氮保护下迅速分装至离心管。点样时注意一次点到位。在将胶转移到EB液里时，切忌皮肤接触，戴手套操作。

实验七RNA分离与纯化一、目的掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程中的各种注意事项。二、原理RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核酸，都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。那么如何区分DNA和RNA分开？DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。另外，RNA的分子量一般比较小，而DNA分子很大且和蛋白结合成复合体，所以DNA更容易随蛋白沉淀，而RNA具有较好的溶解性。 RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃×6h以上。所有的塑料器皿用0.1％的DEPC水37℃过夜浸泡，然后湿热灭菌80℃烘干备用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水，而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应，应避免用DEPC处理。另外操作过程中应戴手套。 判断RNA的质量主要有两个标准，一是纯度，二是完整性（是否被降解）。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带（如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带）。RNA电泳系统也要严格对RNA酶进行处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳，则用尽量减少电泳时间。三、试剂与器材辅助方案：试剂盒提取法（Trizol）（一）试剂：1.TtizolReagent2.氯仿3.异丙醇4.70%无水乙醇5.DEPC（二）器材：1.研钵2.离心机四、实验步骤1.称取小麦叶片600mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移分装到四只1.5ml离心管中。2.加入1mlTrizolReagent，室温放置5min。3.加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min。4.冷冻离心12000rpm×15min。5.将上清液转移到另一个离心管中，加0.5ml预冷异丙醇,混匀，-20℃放置20min。6.冷冻离心12000rpm×10min，弃上清。7.加入0.5ml70%乙醇于RNA沉淀中并悬浮沉淀，10000rpm×2min，除去乙醇。8.加入30μlDEPC处理过的ddH2O溶解RNA。五．实验结果 1.RNA提取的电泳图如下所示： 如图箭头所示即为本组RNA提取的电泳图六．分析与讨论 根据电泳图可知我们提取到了一部分RNA，但是和marker对比，发现我们的条带整个发亮，而不是理想情况下仅有两三条清晰可见的亮带，造成这个现象的可能原因是：跑RNA电泳时，我们所用的电压很高，电泳时间过长；整个条带发亮，可能是提取到的RNA遭到了降解（RNA本身就容易降解）；操作的时候未能够保证完全的无RNA酶环境，造成RNA的部分降解。提取RNA时，必须严格注意以下几点：研磨时不要冻伤小麦幼苗，并快速研磨，待液氮挥发干净的时候停止研磨，迅速转移；操作时切勿说话，戴手套操作，防止RNA降解；弃掉上清后，不要嗑，也不要让吸水纸伸入离心管，因为吸水纸本身就含有酶类，易造成RNA降解。

实验八RT-PCR扩增目的基因cDNA一、目的学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。二、原理普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因，但真核生物的基因组中通常分为可转为mRNA的外显子和不转录的成mRNA的内含子，所以从染色体DNA用PCR方法扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表达。如果用人工的方法把内含子去除，是极其烦琐费力的事。逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶，在反义引物或oligo（dT）的引导下合成mRNA互补的DNA（complementalDNA），再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。这一DNA的5，和3，端经改造可直接用于基因工程的表达，因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。三、试剂与器材（一）试剂1.RNA模板2.cDNA引物3.反转录缓冲液4.dNTP5.MMLV反转录酶6.RNA抑制剂（RNasin）7.Taq酶及10×PCR缓冲溶液8.引物（P1、P2）（二）器材1.PCR扩增仪2.电泳仪3.台式离心机4.恒温水浴四、操作步骤1.RNA的反转录①在PCR管中依次加入RNA模板5μlOlig（dT）18引物1μLDEPCH2O6μL混合后，70℃水浴5min（破坏二级结构），迅速冰浴5min。②在管中依次加入(反应体系为20μL)：5×RTbuffer 4μLRNasin 1μL10mMdNTP 2μL混匀，37℃保温5min。M-MΜLV反转录酶 1μL置于42℃水浴，1h。③70℃保温5min（使酶失活）。2.PCR扩增DNA在灭菌的0.2mlPCR管中，（30μl体系）依次加入10μlcDNA1μlRT引物I1μlRT引物II15μl2×TaqMix3μlddH2OPCR程序：94℃300s94℃45s32cycles:58℃72℃60s72℃600s10℃3.PCR产物的鉴定取20μlPCR产物进行1%琼脂糖电泳分析。五、实验结果 1.RT-RNA的PCR电泳图如下箭头所示即为本组RT-RNA的PCR电泳图六．分析与讨论上图中左半边是P38的酶切电泳条带，右半部分是RT-RNA的PCR电泳图。根据图示，与marker对比，本组条带清晰明亮，效果较好。但是其他组条带微弱甚至不可见，这个原因可能是：1.在实验操作时，没有严格按照无菌操作，导致所提取的RNA遭到降解；2.点样量不足；3.未加反转录酶或者加入量少。实验过程中应该注意的问题：由于RNA极易被环境中的酶所降解，因此，在提取RNA时，一定要保证操作的无菌，具体体现在：操作时切勿说话，戴手套操作，所有与RNA提取相关的仪器和用品皆应该用DEPC液处理（配置Tris相关的缓冲液除外，因为Tris会与DEPC发生反应）。

实验九质粒载体和外源DNA的连接反应一、目的掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。二、原理DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来，该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连接效率。在基因基因工程实验中，最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。进行连接反应时，为了减少片段的自连，通常要进行去磷酸化，去磷酸化可通过碱性磷酸酶完成。比如将目的片段和载体进行时通常要将载体去磷酸化，以减少载体的自连。同要进行连接反应也经常对目的片段进行磷酸化以增强目的片段的连接，在相邻碱基间如果没有磷酸在连接效率大幅下将，如果载体进行了去磷酸化，目的片段可进行磷酸化，以增强目的片段和载体的连接。在连接反应中，目的DNA片段和载体的比例是一个关键问题，对于长度为1kb的片段和3kb的载体而言，通常目的片段和载体的比例设为2：1或3：1，如果目的片段越长该比例应再升高，因为主要考虑的是载体和目的片段之间的分子数的比例。反应体系中核酸的浓度也是一个重要问题，通常反应体系中反应物浓度应保持在25-100ng/μl。连接反应和其它酶不同，需要在较低的温度下进行，通常在12～16℃过夜，也可在4℃过夜连接，如果是平末端连接，可适当提高连接温度。除上述因素外，DNA样品的纯度、盐浓度等会影响连接效率。三、试剂与器材（一）试剂1.目标DNA片段（实验九RT-PCR扩增产物）2.载体（pGEM-TEasy）3.2×ligation缓冲液4.T4DNA连接酶（二）器材1.台式离心机2.恒温水浴3.微量移液器四、操作步骤1.取一个1.5ml离心管依次加入下列试剂:2×ligationbuffer：5μlpGEM-TEasy： 0.5μl目的片段： 2.5μlT4DNA连接酶： 1μlddH2O1μl2.离心机离心30s，使反应体系充分混合。3.4℃过夜连接。

五、分析与讨论 1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。2、在连接反应中，如不对载体分子进行去5"磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。

实验十感受态细胞的制备及转化一、目的掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。二、原理受体细胞经过一些特殊方法如电击法,化学试剂法（CaCl2,RbCl，KCl)等的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。三、试剂与器材（一）试剂1.0.1mol/LCaCl2取202.LB液体培养基（见实验一）3.LB固体培养基（见实验一）4.氨苄青霉素（100mg/mL）（二）器材1.冷冻离心机2.平衡天平3.无菌操作台4.微量移液器四、操作步骤（一）感受态细胞的制备(0.1MCaCl2方法)1.从LB固体平板挑单克隆于5mlLB液体培养基中(不加抗生素)，37℃×200rpm×12-16h，可过夜培养。2.将活化菌体按1`～5％接种到LB中，扩大培养37℃×200rpm×2h，至OD600约为0.4。3.取培养好的菌液1.5ml于一离心管中，4℃离心4000rpm×2min。4.弃上清，加500μl0.1MCaCl2(灭菌预冷)洗菌体，4℃冷冻离心4000rpm×2min。5.彻底除去残液,加200μl0.1MCaCl2(灭菌预冷)，悬浮菌体。6.冰浴静置30min，4℃冷冻离心4000rpm×2min。7.弃上清，加100μl0.1MCaCl2(灭菌预冷)，悬浮菌体，即为制备好的感受态细胞。注意事项：①整个过程注意无菌操作和保持低温。②培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。③如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。④LB液体培养基建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查菌体是否污染。⑤D600值指细胞密度，用于判断培养物是否处于对数生长期。OD600值在0.4-0.5时，此时培养物处于对数生长期，细胞数在20min内加倍。（二）大肠杆菌的转化1.将连接产物加入100μl制备好的感受态细胞，冰上放置30min。2.42℃热激90s。3.迅速冰浴3min。4.加入300μlLB液体培养基，37℃5.加入30μlX-gal和6μlIPTG,混匀。6.取100μl涂布在含有50μg/ml氨苄的LB固体培养基中。7.37℃8.蓝白斑筛选，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。五．实验结果 将经过避光培养的培养基取出，观察到皿内有大量的菌落生长，其中白斑居于大多数，蓝斑零星分布在白斑附近。六．分析与讨论根据蓝白斑筛选原理知：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即没有重组质粒的菌体，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。可见，培养基上绝大多数细胞转化成功。 影响转化的因素可能有： 1.细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或不足均会影响转化率。

2.对以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。

3.

感受态细胞的制备对转化率影响较大。一般未经特殊处理的培养细胞对重组DNA分子不敏感，难以转化成功。4.转化体系中重组DNA的浓度与纯度对转化率也有一定影响。在一定浓度范围内，浓度越高，转化率越高，重组DNA纯度越高，转化率越高。

实验中应该注意的问题： 1.在制备感受态细胞时，首先应该减少管口的敞开，防止杂菌污染；其次在悬浮细胞时应该尽量动作轻柔，用枪头轻轻吹起细胞即可，避免影响细菌活性；最后就是所有操作都应该在冰上进行。2.涂布前玻璃棒要充分冷却，不然会因为温度过高而烫死细菌。3.菌液涂平板的时候要避免来回涂布，否则过多的机械挤压涂布会导致细胞破裂，影响转化效率4.操作过程中要尽量迅速以确保细菌细胞的活性。5.所有的操作都应该在无菌的条件下进行，防止杂菌和其他DNA的污染。

实验十一克隆的筛选和快速鉴定一、目的掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒DNA；和菌落PCR快速鉴定克隆。二、原理在这个实验方法中，只需配制一种细胞缓冲液（它可以在室温下保存，长期使用）。利用破碎细胞缓冲液中的阴离子去污剂SDS在37℃溶解膜蛋白，使细胞破裂，并解聚核蛋白，SDS还能与蛋白质结合形成复合物，使得蛋白质沉淀。利用EDTA螯合金属离子，防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解。然后高速离心，去除细胞碎片核大部分的染色体DNA和RNA蛋白，将含有质粒DNA的上清夜直接进行点样电泳和分离。在琼脂糖凝胶上分离开的个组分中，有染色体DNA，不同大小的质粒DNA和RNA，它们都可以经肉眼观察或拍照显示。或者用设计好的引物，做菌落PCR快速鉴定克隆。三、试剂与器材（一）试剂1.破碎细胞缓冲液50mmol/LTris-HCl(pH6.8)1%SDS2mmol/LEDTA400mmol/L蔗糖0.01%溴酚蓝配制方法：1mol/LTris-HCl(pH6.8)10ml20%SDS10ml250mmol/LEDTA1.6ml蔗糖27.21.2%溴酚蓝1.67ml加ddH2O至200毫升10mg/ml溴乙啶3.TBE电泳缓冲液（5×）4.TaqDNA聚合酶5.10×反应缓冲液（含25mmolMgCl2）6.dNTP7.点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。（二）器材1.电泳仪2.1.53.Tip4.培养皿5.PCR扩增仪6.台式离心机7.紫外分析仪8.恒温水浴四、操作步骤菌落PCR快速鉴定法1.直接用牙签或接种针挑取少许菌体加入25μl或50μlPCR反应体系中。2.用通用引物或特异引物进行PCR，根据扩增条带的有无和大小来判断插入片段的有无、大小及方向（反应体系参照前面实验）。试剂体积（20μl）ddH2O8μlPrimerM13D1μlPrimerM13R1μl模板1个菌落或菌落稀释液2xTaq酶10μl五、实验结果1.菌落PCR电泳图如下所示：图中箭头所示即为本组的菌落PCR的电泳图六．分析与讨论 根据图示可以看见菌落PCR的条带，不过不是很亮，这可能与所加模版液浓度有关，证明了我们将外源基因正确的插入到了菌体当中。比较发现，右边3个菌落PCR条带似有似无，这很可能是菌落出现了假阳性的结果，造成这种现象的原因可能是粘在菌落上的目的基因被污染了。因此为降低菌落PCR假阳性，可以用载体引物代替目的基因引物。

实验十二地高辛标记的Southern杂交一、目的学习Southern杂交的原理及操作方法。二、原理1975年Southern发明了Southernblot分子杂交方法。这项技术包括在琼脂糖凝胶上按片段大小电泳分离待检的DNA；用NaOH对凝胶中的DNA进行变性处理；通过毛细管作用将单链DNA吸附到硝酸纤维素膜上；然后用标记好的探针进行杂交，洗掉没有杂交的游离探针；经放射性自显影（放射性标记探针）或生化检测（非放射性标记）就可以证明基因片段与已知探针是否具有同源性，达到检测样品基因的目的。因此，Southern印迹杂交包括两个步骤=1\*GB3①把电泳分级的DNA转移到固定支持膜上。=2\*GB3②与标记的DNA探针杂交。地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。所用的杂交膜可以选择硝酸纤维素和尼龙膜。硝酸纤维素膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电的膜和不带电的膜两种。带正电的膜对核酸结合力强，敏感性也高。不带电的结合力低。敏感性差。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液（0.1×SSC,0.1%SDS）煮沸5-10分钟后去探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。三、试剂与器材（一）试剂1.DIGRandomLabelingMix（高效）2.Anti-DIG-APConjugate3.BCIP/NBTStockSolution4.BlockingReagent5.20×SSC：0.3M柠檬酸钠，3MNaCl6.2×SSC：0.03M柠檬酸钠，0.3MNaCl7.0.2M8.变性液：0.5NNaOH，1.5MNaCl9.中和度：0.5MTris-HCl，pH7.4，3MNaCl10.Standardbuffer：5×SSC，0.1%(w/v)N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1%BlockingReagent。11.Standardbuffer+50%formamide12.Anti-DIG-AP碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体13.BCIP/NBT储备液：14.冲洗液：0.1MTris-HCl，0.15MNaCl.pH=7.5.15.封闭液：1%BlockingReagent/0.1MTris-HCl，0.15MNaCl.16.显色缓冲液：0.1mMTris-HCl，0.1MNaCl，pH=9.5.17.TE缓冲液：10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0（二）仪器1.台式离心机2.恒温水浴3.白磁盘4.杂交炉5.电泳系统6.硝酸纤维素膜或尼龙膜7.封口机四、操作步骤（一）探针的标记1.用灭菌去离子蒸馏水稀释1μgDNA至总体积16μl。2.DNA热变性：把DNA置于沸水中，水浴10分钟。然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。3.加4μlDIGRandomLabelingMix(高效)，混匀后再2000RPM离心5分钟。4.置于37℃反应至少120分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。5.加入2μlEDTA以终止反应，对于原位杂交和膜反应杂交来说，标记反应可告结束，上述反应液置于-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。可根据下表估计标记产量：单位（ng）DNA模板量标记一小时标记二十小时10456003013010501002701500300450200010008502300300013502650（二）Southern转移1.将目的基因经琼脂糖凝胶电泳的胶板从电泳槽中取出，凝胶浸入0.25MHCl中10分钟。HCl处理的作用主要是通过嘌呤使DNA分子断裂，因而有利于高分子量DNA的转移，但不能处理时间过长。要转移全部小于10kb的DNA片段时可省略此步骤。2.进入变性液之前，用蒸馏水漂洗20-30分钟。3.把凝胶浸入变性液中，室温浸泡15分钟×2次。4.蒸馏水漂洗凝胶2次。5.把凝胶浸入中和液中，室温浸泡15分钟×2次。6.处理凝胶的同时，切一张同样大小的尼龙膜或者硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜用2×SSC浸泡。剪两张Whatman3#滤纸和吸水用的粗滤纸。（注意不要用手直接触及膜面）7.准备转移用平器和支架，平器中放20×SSC。支架上搭滤纸桥使得溶液能够虹吸上来。8.依次放：处理好的凝胶，硝酸纤维素膜，吸水纸，玻璃板，适量重物（500-1000g）。注意：检查pH值，用硝酸膜时pH<9。要确保各层间没有气泡，否则会发生局部绝缘，气泡处的DNA难以吸附到膜上。9.于室温转移12-20小时。10.取出转移膜，用2×SSC漂洗数次，以去处困难吸附在膜上的凝胶。11.固定：硝酸纤维素膜置于普通烘箱中80℃烘烤2小时（三）Southern杂交1.将转移好的尼龙膜或硝酸纤维素膜装入杂交管中，贴壁放置（吸附有核酸的一面不要贴壁），赶走杂交膜和管壁间的气泡。2.加入20mlStandardbuffer，65℃预杂交4-20小时。3.将制备的DNA探针沸水浴加热10min，迅速置冰浴5min。全部加入杂交管。4.使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交16-20小时。5.杂交结束后将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20以备下次使用。这样至少可以保存一年。再次使用之前应在冻融之后，加热至+95℃10分钟以变性探针。6.取出杂交膜，用WashSolutionI洗5分钟×3次。7.保温冲洗：用WashSolutionII于68℃冲洗15分钟×2次。（四）BCIP/NBT显色检测法1.经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡1分钟。2.用干净的平皿，封闭液室温封闭至少60分钟。3.用封闭液1：2500—5000稀释Anti-DIG-AP，例如2μlAnti-DIG-AP加至5-10ml封闭液中（根据染色情况而调整）。稀释液4℃可稳定12小时左右。4.加Anti-DIG-AP，37℃5.用冲洗液洗15分钟×3次，每次100ml。6.按1：50配制底物显色液：例如100μl“BCIP/NTP储备液”加至5ml显色缓冲液中，未用完的显色剂应避光保存。7.显色缓冲液20ml平衡2分钟后倾掉。8.加100ml底物显色液（100cm2）。将膜及显色剂封在塑料袋中，开始避光显色。显色过程中可以观察。一般数分钟即开始出现颜色，显色过程可以持续至12小时。应绝对避免震动，以免出现颜色带的移位。9.当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以终止反应。结果可以进行照相记录；也可以直接保存于TE缓冲液，在此情况下，颜色长期不退。还有一种选择时让膜干燥，颜色消褪。但若将膜放置于TE缓冲液中，显色重新出现。五．实验结果 1.转膜图片 2.转膜后胶的电泳图如下：根据图示发现除了marker还有一点亮带以外，其他均不见电泳条带，可见转膜过程做的很完全，DNA全部被转移到了NC膜上。六．分析与讨论由转膜图片可知，证明基因片段与已知探针具有同源性，达到检测样品基因的目的。只是由于当时显色缓冲液不足量，导致着色并不是很清晰。第一次接触Southern杂交技术，通过听老师讲解原理和操作步骤，自己亲自进行动手操作，才真正的明白了这项技术的原理，掌握了转膜的基本方法和与探针杂交的过程，应该注意的问题比如：不要用手直接接触NC膜；在转膜时，每一层都要用玻璃棒将气泡赶走；用保鲜膜做一次性密封，避免局部绝缘；膜转移时注意正反面放置等问题。小的细节，直接关系到最后实验的成败，所以，在做实验的过程中，训练自己良好的科学素养。

实验十三阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达一、目的学习用诱导物诱导外源基因表达。二、原理 绿色荧光蛋白（GFP）基因来自海底生物多孔水母，该基因表达产物在紫外光照射下可发出绿色荧光。现已将该基因克隆到阿拉伯糖启动子驱动的原核表达pGLO中，通过阿拉伯糖的诱导，可使该基因在细菌中进行表达。三、试剂与器材（一）试剂氨苄青霉素2%阿拉伯糖LB固体培养基（添加amp的终浓度为100μg/ml，添加arabinose为培养基的0.2%）（二）器材1.恒温摇床2.无菌操作台（含酒精灯.）3.紫外灯灭菌锅四、操作步骤1.将实验二中提取的质粒pGLO转化到大肠杆菌HB101中（具体步骤参考实验八）。2.准备四个LB固体培养平板，其中有两个LB/amp平板，一个LB/amp/arabinose平板和一个LB平板。3.将转化菌涂在一个LB/amp和一个LB/amp/arabinose平板上。4.将对照菌涂布在一个LB/amp和一个LB平板上。5.376.紫外灯下进行检测。五、实验结果 1.GFP基因在细菌中的表达六、分析与讨论 在实验过程中，将GFP基因克隆到阿拉伯糖启动子驱动的原核表达pGLO中，通过阿拉伯糖的诱导，可使该基因在细菌中进行表达，表达产物在紫外光照射下可发出绿色荧光，即如图所示。当我们设置了对照组，即另取菌种分别涂布在含LB/amp平板和一个只含LB平