生物分子大实验报告

PAGEPAGE15生物技术大实验试验课教案授课人：陈启龙授课班级：2009级生物技术（本科）授课时间：2011－2012学年度第二学期生物技术大实验实验课总体安排课程名称：生物技术大实验面向专业：生物技术（本科）应开实验时数：48实验类别：基础设置情况：独立设课开课时间：第三学年第二学期考核方式：口试与操作实验目的与要求：通过实验教学，训练学生掌握研究生物技术的最基本操作技能，加深理解生物技术的基本理论，同时培养学生观察、分析、解决问题的能力。试验一感受态细胞的制备一试验目的：理解并掌握感受态细胞制备的技术二试验原理：利用预冷的CaCl2液改变DH5a菌的细胞的通透性，便于质粒的转化。三主要仪器、试剂：分光光度计；恒温振荡培养箱；冷冻离心机；酵母粉；NaCl；胰蛋白胨；CaCl2；DH5a菌；四试验步骤：1.LB培养基的配制：酵母粉2.5g、NaCl5.0g、胰蛋白胨5.0g定容至500ml，pH值7.02.将LB培养基分装：5ml―――离心管100ml――250ml的锥形瓶中（扩大培养用）100ml――250ml的锥形瓶中加琼脂1.7g制平板用其余于500ml锥形瓶中保存备用3.配制0.05MCaCl2,并将以上培养基等灭菌4.接种DH5a菌于37℃倒置培养10-12小时5.挑单菌落于5ml离心管中37℃振荡培养12小时6.扩大培养单菌落，在2小时后开始测OD值，其值在0.3-0.4之间为宜。7.制备感受态细胞1）将对数期菌液倒入5mlEP管，配平，冰浴10分钟，4℃离心（4000r，10分钟）2）去上清，加预冷的CaCl21ml重悬细胞，用枪打散转入1.5mlEP管中3）4℃离心（4000r，10分钟），去上清，CaCl21再重悬一次，4℃离心（4000r，10分钟）4）去尽上清，加150ul0.05MCaCl2重悬，感受态细胞制成，-20℃保存。五结果分析：注意：如果较长时间以后再用，需要在感受态细胞中加入20-40ul的甘油进行保存，温度最好在-40度到-70度之间。实验二质粒的提取与纯化一试验目的：理解并掌握质粒的提取与纯化技术二试验原理：质粒DNA的提取根据实验目的不同，可以有不同的方法，但基本步骤多为三步，第一细菌培养和质粒的扩增，第二细菌菌体的裂解，第三质粒DNA的纯化。三主要仪器、试剂：仪器：超净工作台、超级恒温器或恒温水浴、台式离心机、培养箱、取液器、摇床、冷冻真空干燥器、低温冰箱或冰柜、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪；分光光度计；恒温振荡培养箱；冷冻离心机；试剂１：SolutionⅠ50mM葡萄糖,25mMTris-HCl(pH8.0)10mMEDTA(pH8.0),高压灭菌，4℃保存２：SolutionII0.2MNaOH,1%SDS,现配现用３：SolutionIII5MKAC60ml,11.5冰乙酸，28.5水，4℃保存４：3MNaACpH5.2高压灭菌，4℃保存５：氨苄青霉素50mg/ml,６：溶菌酶７：酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)８：异丙醇９：LB培养基10:电泳试剂见附11:TE缓冲液四试验步骤：含氨卞（100ug/ml）的LB培养基培养菌体37℃200rpm过夜│吸取1.5ml离心，5000rpm,1min沉淀(充分去除LB培养液)加入预冷的100ulSolutionⅠ,充分振荡悬浮加入200ulSolutionII,颠倒徭匀后冰浴中3-5min,加入150ul预冷SolutionIII混匀,冰浴5min离心,12000g,5min取上清酚/氯仿/异戊醇、氯仿各一次，离心5000g5min上清0.6体积的异丙醇,室温,5min,离心,12000g,,5min沉淀冷冻干燥悬于50μldd水或TERNA酶至20ng/ul37-65℃，30-60分钟(可不做)酚/氯仿、氯仿抽提、乙醇沉淀（-70℃，15min/-20℃,2hr）离心10000g，5-10min沉淀―冻干――――复溶-20℃保存───┴───电泳鉴定五结果分析与注意事项１：试剂中所用葡萄糖有增加粘度，降低剪切率，减少DNA的降解２：试剂中所用EDTA有抑制DNase的作用，还能降低离子浓度，而高浓度离子对溶菌酶有抑制作用。３：试剂中所用NaOH能使DNA变性，KAC能使DNA复性，并有助于蛋白等其它大分子成分沉淀。4：如A,不用酚/氯仿抽提;B,LB培养基残留；C，提取中在溶液II中时间过长，导致共价闭合环状DNA不可逆变性，则可能影响酶切。质粒提取方法还有很多，如要进行重组质粒的植物转化或质粒测序则应进行氯化铯梯度离心，或直接采用试剂盒提取。另试剂盒提取可同时进行许多质粒的提取，能在最短时间内获取高质量、高浓度的质粒DNA；如果要提取大质粒DNA则建议使用溶菌酶裂解细胞，以释放质粒DNA实验三质粒DNA提取的检测一试验目的：理解并掌握质粒DNA提取后效果的检测方法二试验原理：利用琼脂糖电泳技术检测质粒DNA提取效果三主要仪器、试剂：琼脂糖凝胶电泳系统；紫外透射仪琼脂糖；溴化乙锭（EB）；TBE缓冲液；四试验步骤：（一）1％琼脂糖凝胶的配制：称取0.5g琼脂糖加0.5×TBE50ml，加热溶化摇匀，在70℃左右加EB2ul，混匀。（二）胶板制备、加样、电泳1.将电泳槽内槽封好，插好样品梳。2.将冷却到50℃左右的琼脂糖液体倒入内槽。3.等胶凝固后取出样品梳，放入电泳槽，向槽内加0.5×TBE缓冲液。4.加样：取DNA10ul与4ul溴酚兰混匀，加入点样孔。5.电泳：150伏电泳，至溴酚兰移至3－5厘米时停止。（三）观察：将凝胶置于紫外透射仪内观察。五结果分析试验四PCR扩增与纯化一试验目的：理解并掌握PCR扩增技术二试验原理：利用DNA天然复制过程，将待扩增DNA片段进行体外扩增，通过变性、退火、延伸三个步骤，理论上单拷贝经过N个循环可获得2N个拷贝。三仪器与试剂：PCR扩增仪；凝胶电泳系统；0.2EP管等DNA模板；buffer;Mg2+;Dntp;上、下游引物，Taq酶；矿物油四试验步骤：（一）PCR扩增1.在0.2EP管中按照下列反应体系(25ul)：bufferMg2+dDTPDNA模板引物1引物2ddH2OTaq酶+ddH2O(ul)2.52.52.01.00.30.313.20.3+2.7混匀，加15ul矿物油，瞬时离心2.97℃预变性7分钟，加Taq酶，瞬时离心。按照下列步骤扩增：94℃40秒；52℃40秒；72℃60秒；35个循环；72℃延伸10分钟；结束或4℃保存。3.扩增产物检测：取5ul产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。（二）目的DNA的纯化1、准备：a、TAE配制：Tris4.84g冰乙酸1.14ml0.5MEDTA1ml定容1000mlb、灭菌：（1）TAE、手术刀、镊子、制胶用锥形瓶、称量纸、双指示剂、量筒等高温高压灭菌。（2）一次性手套、电泳槽、内槽、梳子等先用蒸馏水洗净，再用灭菌的TAE洗净，在紫外线下照射40分钟。制胶：配制0.8％琼脂糖凝胶（TAE）3、加样：样品＋双指示剂（1/4体积）于0.5EP中混匀、加样。4、电泳：100V电压40-60分钟5、切胶收集：用一次性手套垫住于紫外线下切下所需DNA装入纯化柱；按照纯化试剂盒要求操作。检测：于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测目的DNA，五结果分析：1、图中是利用SOX兼并引物进行PCR扩增时获得的SOX基因片段。长度约为220bp。2、纯化过程中切胶过程需十分小心，否则容易带入杂质。实验五PCR产物的克隆一试验目的：理解并掌握外源DNA与质粒的连接以及质粒转化的技术方法；理解并掌握单克隆筛选（蓝、白斑）及菌落PCR技术二试验原理：利用连接酶将外源DNA连接到质粒载体上，并将此质粒载体转化到感受态细胞中；转化成功的克隆会在平板中形成白斑，对白斑进行培养，菌落PCR鉴定假阳性克隆三主要仪器、试剂：恒温水浴锅；恒温振荡培养箱；PCR仪AMP（氨卞）；IPTG；X－gal；TA载体试剂盒；已纯化的PCR产物；LB培养基；AMP；PCR扩增系统四试验步骤：（一）目的DNA的纯化按照实验一中DNA纯化原理及步骤进行，获得纯化的目的DNA。（二）DNA连接反应在0.2EP管中进行连接，总体积10ul，常温连接1小时Puc18载体0.5T4 DNALigase0.5LigasesolutionI4.0PCR产物5.0（三）转化1.将感受态细胞置于冰上，轻轻将细胞悬浮2.取150ul感受态细胞加入10ul连接液混匀，冰浴30分钟3.42℃热休克90秒，冰浴2分钟4.加无AMP的LB培养基300ul，37℃水浴1小时5.倒二板含有AMP固体琼脂平板，每板均匀涂上40ulX－gal和4ulIPTG的混合液，停1-2分钟待略干后加转化液每板105ul6.室温平放20分钟，倒置37℃培养12小时，观察（四）克隆与鉴定A单克隆的筛选及培养1.观察上述试验的平板，发现有蓝白斑出现2.挑选白斑菌落分别于若干支含有AMP的LB培养基中37℃振荡培养8－10小时B煮沸法提取质粒DNA1.取0.5ML菌落与0.5EP管中，瞬时离心（4000r）去上清2.加无菌水50ul左右，100℃煮沸10-15分钟3.12000r离心10分钟，取上清。C菌落PCR1.取上述上清1ul作为模板进行PCR扩增。2.检测：于琼脂糖凝胶电泳检测五结果分析图中所示为蓝白斑筛选结果。下图中所示为菌落PCR结果。试验六DNA探针制备一、实验目的：了解并初步掌握DNA探针的制备及标记方法。二、实验原理：核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的寡核苷酸链。核酸探针有双链DNA探针、单链DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。特异性探针来源于目的核酸的酶切片断、dd-PCR等差异显示中出现的差异片断、AFLP、RFLP、RAPD、SSR、CFLP等标记实验中出现的特异性基因标记片断。可以通过人工合成、酶切、PCR等手段富集探针。探针必须带上标记才能有用，不带标记的探针称为裸探针。探针标记是进行杂交及一些分子标记研究的前提。探针标记有单链标记、双链标记、直接标记及间接标记，放射性标记和非放标记。本实验主要使用光敏生物素对探针的标记。在强可见光的照射下，光敏生物素中的N3基团光解放出N2,生成反应活性极高的氮烯；N基团，易与核酸碱基中的伯胺基结合而形成共价标记。核酸中每100-150个碱基可结合一个生物素。三、主要仪器、试剂：仪器：光标记灯离心机试剂：光敏素试剂盒光敏素试剂醋酸盐亲和素－碱性磷酸酶检测系统亲和素－碱性磷酸酶BCIP(实验时10mg溶于200μlDMF中)NBT(实验时15mg溶于200μl70%DMF中)二甲基甲酰胺（DMF),仲丁醇,3ＭNaAC无水乙醇四试验步骤：（一）核酸探针的光敏素标记１：在一支灭菌的Eppendof离心管中加入20μl探针DNA(0.5-1μg/μl，溶解于水中2：避光条件下加等体积的光敏生物素醋酸盐并混匀。3：将装有反应液的离心管置于冰模中，暗室中在光标记灯下照射30分钟（灯距样品15cm）。4：加入无菌水至总体积为100μl5：加入100μl仲丁醇，混匀。10000rpm离心10min,去上层液，再加入仲丁醇，离心，使水相浓缩至30-40μl。6：加入4μl的3MNaAC,混匀，再加入２体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃过夜或-70℃15min7：4℃15000rpm离心15min,取桔红色沉淀。8：真空干燥，沉淀溶于无菌水中。五、结果分析与注意：1、仲丁醇与水能部分互溶，因此最好先用水将其饱和，以防DNA丢失，如不饱和则可起到浓缩水相的作用，2、买来的或要来的探针一般都保存在TE缓冲液中，因此在使用前脱盐，否则光敏素与Tris反应，使电泳条带拖尾。3、在沉淀探针时，NaAC能不加，尽量不加。沉淀离心是最好在低温下进行，试验七SSCP分析一试验目的：理解并掌握聚丙烯酰胺凝胶的配制及单链构象多态性分析二试验原理：SSCP分析是将dsDNA经变性为ssDNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳会将不同分子量和不同构象的ssDNA区分开来，一般可以检测到一个碱基的变化，三主要仪器、试剂：垂直电泳槽丙烯酰胺（ACR），甲酰胺；四甲基乙胺（TEMED）；N-N甲叉双丙烯酰胺（Bis）；双指示剂；5×TBE；10％过硫酸胺（AP）；甘油，乙醇（95％）；冰乙酸；硝酸银；NaOH；甲醛；PCR产物四试验步骤：1.6％非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制：20ml1).30％非变性ACR液4ml(配制：ACR29g，Bis1g加水100ml)2).5×TBE4ml3).10％AP140ul4).TEMED20ul5).加水直到20ml2.灌胶：在垂直电泳槽的2块玻璃板间灌胶3.预电泳：放好玻璃板，在槽内加入1×TBE缓冲液，200V预电泳30分钟4．加样、电泳：取PCR产物4ul加甲酰胺8ul、双指示剂4ul、混匀于98℃变性10分钟，冰浴2分钟，快速加样，200V电泳3-4小时。5.固定：电泳结束后，取下玻璃板将胶剥下，加入固定液（95％乙醇10.5ml，冰乙酸5ml，加水定容到1000ml），在摇床中轻摇15分钟，双蒸馏水漂洗3次，每次2分钟6.染色：加入染色液（硝酸银2g，加双蒸馏水定容到1000ml），轻摇15分钟，快速漂洗3次，每次20秒。7.显色：加入显色液（NaOH15g，37％甲醛10.8ml，加双蒸馏水定容到1000ml），轻摇到有清晰条带出现。8.拍照。五结果与分析：1、变性是否彻底是否重要，因为单链效率影响实验结果。2、最后固定、染色、显色的操作需要小心。试验八RACE技术一试验目的：理解并掌握RACE技术的试验原理，并能运用该技术获得全长基因二试验原理：RACE技术全称为cDNA末端快速扩增技术（RapidAmplificationofcDNAEnds）.它是由已知部分cDNA序列来获得全长cDNA的3端和5端，又叫AnchorPCR/One-sidePCR。三主要仪器、试剂：PCR仪；RACE试剂盒四试验步骤：（一）3ˊRACE的获得1.在总RNA中加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到（-）cDNA；2.以oligo(dT)17和一个35bp的接头（dT17-adaptor）为引物，再用一个基因特异性引物（3ˊamp）与少量第一链（-）cDNA退火并延伸，产生互补的第二链（+）cDNA。3.利用3ˊamp和接头引物进行PCR循环进行扩增得到cDNA双链。3ˊRACE技术的实验路线如下图所示：5ˊAAAAAAAAAAVTTTTTTTTTTPCRProductreadyfor（二）5ˊRACE的获得5ˊRACE与3ˊRACE略有不同。引物多设计了一个用于逆转录的基因特异引物GSP-RT。在酶促反应中增加了逆转录和加尾步骤，即先用GSP-RT逆转录mRNA获得第一链（-）cDNA后，用脱氧核糖核酸末端转移酶和dATP在cDNA5ˊ端加poly(A)尾，再用锚定引物合成第二链（+）cDNA。接下来与3ˊRACE过程相同。用接