昆虫表达系统

基因表达与调控真核表达_昆虫杆状病毒表达系统真核表达系统的种类和常用载体1.真核表达系统的种类酵母丝状真菌昆虫哺乳动物细胞转基因动物植物反应器2.真核表达载体质粒：真核表达元件、真核抗性病毒载体：改建后SV40病毒腺病毒反转录病毒痘苗病毒SV40病毒《SV40》(Simianvacuolatingvirus40orSimianvirus40)是猴空泡病毒40，猿猴病毒40或猴病毒40的缩写，多瘤病毒科，这是在人类和猴子都发现的致瘤病毒。SV40病毒的基因组是一种环形双链的DNA，基因组5.2kb，病毒的直径45nm，病毒成熟部位细胞核，无被膜，62个核壳粒亚单位，这种大小很适于基因操作。同时它也是第一个完成基因组DNA全序列分析的动物病毒。以单纯疱疹病毒为例。（1）病毒与细胞结合；（2）病毒进入细胞，去包膜；（3）脱壳；（4）病毒DNA进入细胞核；（5）病毒基因组复制，合成子代病毒及病毒mRNA；（6）以病毒基因转录的mRNA进入细胞质；（7）病毒mRNA翻译病毒子代蛋白，包括早期蛋白和晚期蛋白；（8）装配子代病毒；（9）出核，同时披上包膜；（10）释放到胞外病毒复制（SV40示例）病毒基因组的结构特点病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组很小

病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成多数RNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成，病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的，噬菌体（细胞病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续的，无内含子基因重叠即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子，病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位,形成一个功能单位或转录单元，多顺反子除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次构建真核表达系统_细胞必需表达元件原核DNA序列启动子增强子拼接信号终止子和多聚腺苷化信号筛选标记动物病毒基因序列病毒载体优点真核细胞可识别的启动子报告基因感染周期，可持续复制部分载体可整合入基因组部分载体本身带有完整的复制及表达元件部分载体具有宿主细胞特异性识别受体假病毒颗粒杆状病毒及其基因组模型昆虫杆状表达系统简介杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群,发现最早、研究最多且实用意义很大的昆虫病毒。20世纪80年代以来由于杆状病毒表达载体系统（baculovirusexpressionvectorsystem，BEVS）的建立,已被公认为是当今基因工程四大表达系统之一。该系统具有许多优点,如多角体启动子控制下的高效表达,完善的转译后加工修饰,较易从无血清培养上清中纯化的蛋白,无内毒素污染等。杆状病毒载体系统主要分为两大类,一类是用于表达单个外源基因的载体,另一类是多元表达载体,用于插人并表达2个或多个外源基因杆状病毒_昆虫表达系统杆状病毒基因组：闭环双链DNA，88-166kb启动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强启动子表达系统（两种）杆状病毒表达系统（BEVS）家蚕核型多角体病毒-家蚕表达系统宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅目、毛翅目的600多种昆虫克隆基因方法：转移载体→共转染→同源重组→空斑筛选→纯化→重组病毒昆虫杆状病毒表达系统的分子基础目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)、家蚕核多角体病毒(BmNPV)、黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)、舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒(LdMNPV)、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒(SeMNPV)、棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)以及斜纹夜蛾核型多角体病毒(SplMtNPV)杆状病毒在其生活史中共有两种形式的表型存在,在感染的初期(0~24h),主要以细胞释放型病毒粒子(cell-releasedvirus,CRV)为主,也称为胞外型病毒(extracellularvirus,ECV)或出芽型病毒(Buddedvirus,BV);在感染的晚期主要以包埋型病毒(occludedvirus,OV)的形式存在。杆状病毒的这两种表型的形态、蛋白组成、病毒囊膜的来源、感染组织特异性以及病毒入侵宿主细胞的方式都不相同。由于两种表型的病毒在结构组成上的差异,所以杆状病毒在不同的时期需要表达不同类型的蛋白来满足病毒颗粒不同形式的组装。昆虫杆状病毒的基因表达共分为4个时期:极早期、早期、晚期、迟晚期。4个时期的基因一环扣一环,按时间先后,以级联方式严格制约。早期表达的基因有ie-1、me53、pe38、ie-2等,晚期表达的基因有vp39、vp80、polh、p10等,这些不同的基因所表达的蛋白各自具有不同的功能,有些表达产物具有调控的功能,而有些仅仅只具有结构蛋白的作用。在杆状病毒所表达的一系列蛋白中,有一类蛋白具有较高的表达量,并且均为病毒基因组复制所非必需,其中最具代表性的有多角体蛋白与P10蛋白,均属于晚期表达的蛋白,受晚期启动子的调控。昆虫的杆状病毒表达系统正是利用了这类蛋白的优点,从而提供了外源DNA插入座位。杆状病毒表达系统优点容量大：能插入12kb的外源基因高表达：采用的polh基因启动子是目前所知的最强的真核启动子；产物对宿主影响小；产物可结晶高效：可同时表达多个基因安全：杆状病毒对脊椎动物无病原性具加工修饰功能：昆虫细胞属较高等真核细胞家蚕表达系统中，家蚕易饲养表位标记与构建重组体注意事项表位：抗原决定簇即抗原分子于一特定抗体结合的化学基团，一般由少至几个氨基酸的多肽组成用于重组DNA技术的示踪、分析、纯化（亲和）优点用一种抗体可鉴别不同