基于ql-1spoiie基因敲除的菌体形成及淀粉酶酶活的研究

基于ql-1spoiie基因敲除的菌体形成及淀粉酶酶活的研究

克林波特阳性植物是一种生产c-li积聚酶的阳性植物。它可以产生各种酶，主要包括碱性酶和淀粉酶。目前国内外多以枯草芽孢杆菌为模式菌株,对芽孢形成机制及关键基因进行了大量研究目前国内外对芽孢杆菌淀粉酶产量方面的研究,多集中在培养基、工艺参数以及淀粉酶基因克隆的外源表达1材料和方法1.1实验仪器和设备克劳氏芽孢杆菌(B.clausiiQL-1)野生菌株;pHT01质粒用于CmZQZY-CS恒温振荡培养箱上海知楚有限公司;GNP-9080型隔水式恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司;Centrifuge5804R低温冷冻离心机、4380型电转仪德国Eppendorf公司;Veriti96孔热循环梯度PCR仪美国应用生物系统公司;MD2000H核酸超微量分光光度计美国BioFure公司;UVIEssentialV6凝胶成像仪英国Uvitec公司。1.2实验方法1.2.1引用设计spoIIE基因扩增引物spoIIEF1/spoIIER1,Cm1.2.2spoiie片段的获得使用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取B.clausiiQL-1菌体基因组,使用高纯度质粒小量提取试剂盒提取pHT01质粒,以B.clausiiQL-1菌体基因组为模板spoIIEF1与spoIIER1为引物PCR扩增获得spoIIE片段;以pHT01质粒为模板,Cm1.2.3同源重组片段speiie-cm将1.2.2所得的spoIIE-Cm1.2.4菌株的活化培养甘油管挑取一接种环B.clausiiQL-1菌液划线于LB平板,37℃培养18h,反复活化两代,挑取二代平板上的单菌落接种于15mL的LB培养基,37℃、200r/min培养12h;将菌液转接于50mL菌体增殖培养基中,使初始菌液OD1.2.5同源重组片段speiie-cm将制备的B.clausiiQL-1感受态细胞与spoIIE-Cm1.2.6芽孢生成率测定B.clausiiQL-1与B.clausiiQL-1ΔspoIIE菌株分别以2%接种量接种于LB液体培养基,37℃、200r/min培养28h,菌液于80℃水浴处理10min,将未处理的菌液与处理的菌液分别稀释适当倍数涂布于LB固体平板上,37℃培养18h,平板计数法记录并计算芽孢生成率,产芽孢率(%)=芽孢数/(芽孢数+营养细胞数)×100。1.2.7ql-1spoiie生长周期及培养条件挑取B.clausiiQL-1与B.clausiiQL-1ΔspoIIE单菌落于15mLLB液体培养基,37℃、200r/min培养12h,将菌液转接至100mLLB液体培养基至初始OD1.2.8观察圈大小、两相外包分别将出发菌株B.clausiiQL-1和重组菌株B.clausiiQL-1ΔspoIIE单菌落点涂于淀粉平板中央,于37℃培养,滴加碘液观察并测量透明圈大小。分别以2%接种量接种于发酵培养基,37℃、200r/min培养,每隔6h取样,4℃、12000r/min离心8min取上清,按照国标GB/T24401-2009所示方法测定淀粉酶酶活,按菌体干重换算为U·g酶活定义:于60℃,pH6.0条件下,1h液化1g可溶性淀粉,即为一个酶活力单位(U·mL1.2.9b.cladio-1spie补料与未补料发酵的比较1.3处理数据本文中引物设计采用Oligo7设计,实验采用三次重复,数据由Execl处理,Origin8绘制图形。2结果与分析2.1pcr扩增确定以B.clausiiQL-1出发菌株基因组为模板,spoIIEF1和spoIIER1为引物进行PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图1(a),成功获得791bp的spoIIE片段;以质粒pHT01为模板,Cm2.2对重组菌株的筛选和遗传稳定性的评价将spoIIE-Cm2.3spioie基因对发芽和细菌体重干重的影响通过平板计数法对出发菌株及重组菌株芽孢萌发情况进行比较,结果见图3,B.clausiiQL-1芽孢萌发数为3.93×102.4spoie菌株对淀粉水解圈的生长可溶性淀粉平板初筛,结果见图6,重组菌株B.clausiiQL-1ΔspoIIE较出发菌株B.clausiiQL-1淀粉水解透明圈明显增大,B.clausiiQL-1ΔspoIIE菌株淀粉水解透明圈与菌落直径比为2.96,B.clausiiQL-1透明圈与菌落直径比为1.42,可以得知重组菌株较出发菌株水解淀粉能力明显增强。进一步对重组菌株及出发菌株于发酵培养基发酵培养并测定淀粉酶酶活,结果见图7,B.clausiiQL-1ΔspoIIE及B.clausiiQL-1菌株发酵至84h淀粉酶酶活分别为4.8×102.5菌体干重测定对B.clausiiQL-1ΔspoIIE进行初步补料发酵,补料结果如图8所示,菌体的生长在20~30h内趋于平稳,30h开始补料,35h后生物量逐渐升高,对数生长期延长、生物量增大,菌体干重测定如图9所示。由图8和图9可知,进行补料的B.clausiiQL-1ΔspoIIE菌株OD3poiiie菌液的制备利用重叠PCR技术,通过电转化将重叠片段spoIIE-Cm将B.clausiiQL-1ΔspoIIE菌液以2%接种量转接至两瓶1