关节腔注射双醋瑞因对sd大鼠骨关节炎形态及关节滑膜组织ed1、col2表达的影响

关节腔注射双醋瑞因对sd大鼠骨关节炎形态及关节滑膜组织ed1、col2表达的影响

骨关节炎（oa）是一种退行性关节病，以关节疼痛、畸形和功能损伤为特征，严重影响了老年人的生活质量。骨关节炎是由多种细胞破坏因子和炎性因子参与、以关节滑膜病变、软骨变性破坏、软骨下骨增生为主的病理过程1材料和方法1.1成虫体质量1.1.1实验动物健康成年SD大鼠[昆明医科大学实验动物室提供,SD大鼠,SPF级,实验动物生产许可证SCXK(滇)2011-0004]35只雌体,个体质量约0.20kg。1.1.2主要试剂与仪器ED1抗体(FunakoshiCo.,Ltd.Japan公司),胶原蛋白II抗体(DaiichiFineChemical,Toyama,Japan),NiKonYS700型显微镜,LEICARM2135切片机,YT-6C生物组织摊片机,LEICATP1020全自动脱水机。1.2组dar、双醋瑞因、dar制剂的联合研究1.2.1动物分组及造模A.正常对照组:自然喂养15只,与手术组同时间各取3只处死,得左右共6个全膝;n=3。B.手术后二甲基亚砜对照组及DAR治疗组:结合Hulth造模方法1.2.2药物双醋瑞因(diacerein,DAR)粉剂,由瑞士赞备臣制药有限公司(TRBPHARMAS.A)提供。根据成人用药量与实验动物用药的换算公式1.2.3给药方法手术后第3d开始每天给予注射治疗,术后右膝(DAR治疗组)关节腔内注射双醋瑞因液0.1ml,术后左膝(二甲基亚砜治疗组)关节腔内注射二甲基亚砜0.1ml,所有SD大鼠自然喂养。1.3免疫组织化学1.3.1标本制作乙醚吸入麻醉后,采用瞬间颈椎脱位法处死大鼠,取全膝关节,去皮后快速置入4℃4%多聚甲醛(PFA)固定。经20%已二胺四乙酸(EDTA)脱钙后,把全膝关节沿髌尖韧带正中线行矢状面切开一分为二,再按常规系列脱脂、脱水、石蜡包埋、切片厚5μm于4℃冷藏备用1.3.2免疫组织化学染色石蜡切片脱蜡至水;3%H1.3.3阳性表达半定量法ED1阳性细胞计数采用Scionimage软件进行统计。对滑膜组织中出现的棕褐色阳性细胞进行分析,每张切片在200倍镜下随机选取不相重叠的5个代表性视野,测量单位面积阳性细胞及阳性纤维的个数1.4免疫组化检测正常sd大鼠中ed1阳性细胞StatView5.0统计软件(SASInstitute,Cary,NC)处理数据,计量资料采用平均值±标准差表示,组间比较用One-WayANOVA方差分析,Mann-WhitneyU-test检验。前期SD大鼠交叉韧带切断造模试验研究见OA模型与正常SD大鼠各项指标有明显差异ED1免疫组化观察:图1、表1结果显示,正常对照组滑膜组织中可见极少数ED1阳性(棕褐色)细胞;术后二甲基亚砜治疗组(对照组,左膝)在1、2、3周均可见滑膜组织ED1阳性细胞升高明显;术后DAR治疗组(右膝)滑膜组织ED1阳性细胞升高不明显,到实验后期ED1阳性细胞接近正常;两组滑膜组织ED1阳性细胞表达有显著性差异(P<0.01)。2结果2.1滑膜组织2.2软骨破坏现象TB染色显示软骨细胞破坏,术后二甲基亚砜治疗组(对照组,左膝)软骨层变薄,部分地方出现软骨缺损,如图2所示,随着时间的推移软骨破坏越来越重。术后DAR治疗组(右膝)软骨细胞起初有一定的破坏,至第14d后软骨细胞破坏不再加重。2.3软骨间col2含量的变化通过对软骨Ⅱ型胶原蛋白(COL2)免疫组化染色,发现术后二甲基亚砜治疗组(对照组,左膝)关节软骨中软骨Ⅱ型胶原蛋白(COL2)丢失较快,8周时COL2几乎完全丢失,如图2所示;术后DAR治疗组(右膝)关节软骨COL2丢失较少,8周时COL2与正常组差异不大,见图3示。DAR治疗可以减少COL2的流失,促进软骨细胞增生。3双醋瑞因的结构骨关节炎(OA)系多种病因导致关节的关节间应力不均且具有关节软骨的退行性变和继发性骨质增生为发病特点。本试验前期结合Hulth本试验对照组采用关节腔注射二甲基亚砜,并进行同体左右膝两组之间的对照,排外注射操作及个体差异对试验的影响。双醋瑞因,又叫二乙酰大黄酸,其化学结构为4,5-二乙酰-9,10-二氢-9,10-二氧-2-蒽羧酸,属蒽醌类的化合物。双醋瑞因易溶于二甲基亚砜、二甲基乙酰胺;难溶于水、甲醇、氯仿。双醋瑞因进入体内迅速分解为大黄酸(rhein),活性代谢物大黄酸循环到关节腔通过抑制白介素-1(IL-1)转换酶,减少IL-1β的产生和减少IL-1β活性而发挥作用骨关节炎病人的软骨细胞中发现有大量的IL-1受体和尿激酶受体双醋瑞因的活性代谢物大黄酸在肠道吸收较少,大黄酸与肠内菌作用,转化产物大黄酸蒽酮有泻下活性,能够降低结肠对钠和氯离子的吸收,增加钾离子分泌。口服双醋瑞因起效缓慢。二甲基亚砜模型组骨关节炎滑膜组织随着时间的推移,初期(3~7d)滑膜组织单克隆抗体(ED1)细胞的数量逐渐增多,随着骨关节炎加重,滑膜组织中ED1阳性细胞的数量维持在一定水平,与前期的试验结果一致4双醋瑞因关节腔注射治疗骨关节炎的临床效果通过同体SD大鼠左右膝同法造模分别注射二甲基亚砜和双醋