第7章 蛋白质性质与分离纯化

蛋白质的性质与分离纯化主要针对可溶性天然球蛋白蛋白质的酸碱性质蛋白质中氨基酸残基的侧链，如氨基、羧基、羟基、咪唑基等可以解离，因此蛋白质是两性电解质。蛋白质的带电情况与所处环境的pH有关，调节溶液的pH可以使蛋白质带正电、带负电、或不带电荷。蛋白质的等电点：使蛋白质的净电荷为零的溶液pH，此时蛋白质分子所带的正电荷与负电荷相等，蛋白质在电场中不移动。等电状态的蛋白质溶解度最小。

蛋白质两性解离性质和等电点pH=pI

净电荷=0

pH<pI净电荷为正pH>pI净电荷为负PrCOOHNH3++H++OH-+H++OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+

当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（isoelectricpoint，pI）蛋白质的胶体性质蛋白质分子量大，达到胶体质点的范围(1-100nm)。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。蛋白质水溶液是亲水胶体溶液。不能透过半透膜，可通过透析的方法将蛋白质和小分子分开。两个稳定因素：蛋白质分子表面有许多亲水基团，在其表面形成一层水膜（水化层）蛋白质分子表面具有许多可解离的基团，在一定pH条件下，能与其周围电性相反的离子形成双电层。蛋白质的沉淀作用如果破坏蛋白质溶液的稳定因素（水化层，双电层），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。

沉淀方法类别:1、高浓度中性盐（盐析）

2、酸碱（等电点沉淀）

3、有机溶剂沉淀

4、重金属盐类沉淀

5、生物碱试剂沉淀

6、加热变性沉淀可逆的沉淀作用去除沉淀因素后（如用透析的方法）蛋白质能恢复溶解状态。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法和盐析法等。盐析法:在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析。盐溶作用：稀盐溶液中，蛋白质溶解度增加。不可逆的沉淀作用在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀、有机溶剂沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀蛋白质分子量的测定根据化学组成测定最小相对分子质量首先利用化学分析方法测定蛋白质中某一微量成份的百分含量然后，假定蛋白质分子中该成份只有一个，据其百分含量可计算出最低相对分子质量：最小相对分子质量＝微量成分的相对分子或原子质量/该成份的百分含量如果蛋白质分子中所含成分不是一个，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。例P317.1测得一种血红素蛋白含0.426％铁，计算最低Mr。一种纯酶含Leu1.65％和Ile2.48％，求最低Mr。解答：血红素蛋白最低Mr＝55.8/0.426%=13100纯酶以Leu计算最低Mr＝131/1.65%=7940以Ile计算最低Mr＝131/2.48％=5300实际最低分子量＝7940*2或5300*3，约15900蛋白质分子量的测定凝胶过滤法原理：根据分子量大小不同测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量蛋白质分子量的测定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）法SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂普通蛋白质电泳的泳动速率取决于净电荷、大小、形状用SDS和巯基乙醇处理，蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物此时，不同蛋白质分子均带负电，且荷质比相同（SDS带负电，蛋白质分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少，结果蛋白质上的电荷量远超过了蛋白质本身的电荷量）不同蛋白质分子具有相似的构象（SDS-蛋白质复合物是长椭圆棒）此时蛋白质的泳动速率完全取决于凝胶的分子筛效应（颗粒小移动快，颗粒大移动慢）。结果蛋白质电泳的迁移率只与其相对分子质量的对数呈线性关系。用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图测出待测样品的迁移率从标准曲线上查出样品的相对分子质量蛋白质分离纯化的一般程序前处理

生物组织破碎溶解离心

无细胞提取液粗分级

盐析等电点沉淀超滤有机溶剂分级

浓缩的蛋白质溶液细分级

层析电泳

精制品结晶/冻干粉蛋白质分离纯化的一般原理1、根据分子大小不同：透析、超滤、凝胶过滤2、根据溶解度差别：等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀3、根据电荷不同：电泳、离子交换层析4、根据对配体的特异生物学亲和力：亲和层析利用溶解度差别常用的粗分级方法等电点沉淀控制溶液pH，使蛋白质处于等电点，蛋白质净电荷为零，溶解度最低。盐析中性盐破坏蛋白质的稳定，使蛋白质沉淀，常用硫酸铵。有机溶剂分级沉淀常用乙醇、丙酮根据分子大小不同透析和超滤：蛋白质胶体性质的应用透析（dialysis）：利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。超滤（u