从高碳醇萃取林可霉素的研究

从高碳醇萃取林可霉素的研究

林可霉素是林可链霉菌变异引起的抗生素。它对大多数常见的革兰氏阳性菌都有抗菌活性，并且抗药性发展缓慢。对呼吸、骨骼和软组织的感染也有良好疗效。林可霉素A的结构式如图1所示。除林可霉素A外,林可霉素产生菌在一定条件下还产生B、C、D等类似物(表1),除了林可霉素C的抗菌活性与林可霉素A相同外,其余都较差,没有实用价值。国内林可霉素生产厂家发酵产物以林可霉素A为主,同时也含有约10%的林可霉素B。林可霉素B抗菌活力较小,在产品中含量应控制在较低水平。随着林可霉素更多地被作为半合成抗生素的原料来使用,对于降低其中林可霉素B含量的要求也在提高。从发酵液中提取林可霉素,国内多采用丁醇提取工艺,萃取时对林可霉素B几乎没有分离作用,产品中林可霉素B含量较高。为了提高提取收率和产品纯度,一直在进行更有效的新提取工艺的研究工作。高碳醇对林可霉素A有较高选择性,以高碳醇为萃取剂,有利于降低产品中林可霉素B含量;高碳醇的水不溶性和高沸点,有利于减少溶剂损失。本文以降低产品中林可霉素B含量为目的,研究了以混合高碳醇为溶剂的提取工艺路线,重点考察了工艺中关键性问题。在此基础上,还验证了保留原丁醇提取工艺,利用混合高碳醇萃取对林可霉素产品进行纯化的可行性。1材料和方法1.1林可霉素盐酸盐标准品发酵滤液由抗生素生产厂家提供,是放罐后发酵液经酸化后过滤所得清液,化学方法定效价其中含有10%的林可霉素B。林可霉素盐酸盐标准品由上海市药品检定所提供。实验中所用的林可霉素丁醇提取一次结晶、二次结晶分别为林可霉素生产厂家丁醇提取工艺的中间产品和成品,其中林可霉素B的含量分别为5.2%和4.2%。1.2样品含量测定萃取、碱洗、反萃实验在带恒温夹套的分液漏斗中进行,恒温25℃下操作,振荡10min以确保达到平衡。根据所需的操作级数,采用多只分液漏斗串联,模拟进行多级逆流实验,直到操作达到稳定为止。反萃液在旋转蒸发器中进行减压浓缩,温度50～60℃,真空度为5.33～6.67×104Pa。林可霉素结晶在真空干燥器中50℃下烘干。林可霉素和氯化钯在酸性条件下反应生成有色络合物,在380nm处有明显吸收峰,利用此性质采用分光光度法分析林可霉素含量(包括A和B组分)。测定发酵液效价时,调节发酵液pH11～12,再用正丁醇萃取,取丁醇提取液,用95%乙醇稀释至适当浓度后显色分析。分析有机相中林可霉素含量时,用95%乙醇稀释至适当浓度后进行显色。以林可霉素盐酸盐标准品作标准曲线,样品分析结果以林可霉素A盐酸盐的形式来表示。产品中林可霉素B的含量采用HPLC分析,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;0.05mol/L硼砂溶液(用85%磷酸调pH值至6.0)∶甲醇(4:6)为流动相;检测波长214nm。2结果与讨论2.1高碳醇萃取剂最佳条件以高碳醇为萃取剂从发酵液中提取林可霉素时,由于萃取剂的改变,原先以丁醇为萃取剂提取工艺的条件要发生较大变化:(1)以高碳醇为萃取剂时容易发生乳化,需采取发酵滤液絮凝处理、调节混合醇组成等措施,以解决乳化问题;(2)高碳醇对林可霉素的萃取能力显著小于丁醇,为保证较高的提取效率,萃取级数、相比等有较大改变,洗涤和反萃取等操作条件也有相应变化(图2)。2.1.1甲壳素和硫酸铝钾的用量对产酶环境质量的影响发酵滤液在放罐后已经进行了草酸酸化处理,去除大量的蛋白质等杂质。由于在偏碱性条件下,高碳醇萃取时易发生乳化现象;为了减少高碳醇萃取时的乳化,萃取实验前还需对发酵滤液进行絮凝处理,再去除部分蛋白质等表面活性剂杂质。调节发酵滤液pH至10.0,加入甲壳素溶液、硫酸铝钾[KAl(SO4)2·12H2O](用量分别为发酵液的1%和0.2%),用NaOH溶液调pH至9.0,絮凝3h;最后再加入NaOH溶液,调pH至10.0,过滤除去絮凝沉淀。絮凝过程中效价回收率为98.9%。甲壳素和硫酸铝钾起絮凝剂作用,使发酵液中剩余的部分蛋白质沉淀析出,有利于改善萃取后的分相情况,减少乳化损失。实验中,减少甲壳素溶液(0.1%～0.5%)和硫酸铝钾(0.05%～0.1%)的用量,析出絮凝沉淀显著减少;增加甲壳素(1.5%～2%)、硫酸铝钾的用量(0.3%～0.4%),过滤所得的絮凝沉淀量没有进一步增加;因此,下文的萃取实验中,发酵滤液按照甲壳素溶液、硫酸铝钾加入量分别为发酵液的1%和0.2%,进行絮凝处理。2.1.2林可可霉素的提取(1)萃取有机相的制备表1所示为不同组成的萃取剂对林可霉素萃取实验结果。水相为二次结晶林可霉素溶液,浓度4000μg/ml,pH=10,有机相由正辛醇(C8)和正癸醇(C10)以不同配比混合而成,25℃下萃取,相比VO/VA=1/3。尽管增加辛醇含量可略微增加有机相的萃取能力,但考虑到分相速度以及对林可霉素A、B组分的萃取选择性,下文中萃取实验均采用80%正辛醇∶20%正癸醇的混合配比。(2)不同ph值萃取溶剂单级萃取在偏碱性条件下,林可霉素容易被从水相萃取入有机相中。以二次结晶林可霉素水溶液调节至不同pH值,用80%辛醇∶20%癸醇为溶剂进行单级萃取,结果如图3所示。由图3可见,保持较高pH值(接近10.0),对萃取操作有利。但过高的pH,不仅要消耗较多的碱,而且会加速林可霉素的分解。选取pH10为较适宜的萃取条件。(3)萃取分配比对萃取收率的影响二次结晶林可霉素水溶液调节至pH10.0,以80%辛醇∶20%癸醇为萃取剂在不同温度下进行单级萃取,结果如图4所示。由图4可见,在较高的萃取温度下(接近60℃),可以得到较大的萃取分配比(较常温下高出40%～50%),对提高萃取收率有利。但过高的温度会增加溶剂挥发损失,对操作环境污染较大。为了减少溶剂挥发损失,萃取应在较低的温度下进行,同时可以适当增加多级逆流萃取的级数来保证萃取收率。下文中多级萃取、洗涤和反萃取在25℃下进行。(4)林可霉素在不同浓度混合醇萃取中的稳定性对酸化后发酵滤液进行絮凝处理,调节pH至10.0,效价为3249μg/ml,25℃下用80%辛醇∶20%癸醇进行12级逆流萃取,相比VO/VA=1/3。模拟实验达到稳态操作时,各级有机相和水相中林可霉素的化学效价如图5所示。从有机相出口浓度来计算,12级萃取的提取收率为92.8%。可见,采用12级逆流萃取,可以保证足够高的萃取收率。图5中,在低浓度范围内,D显著减小。林可霉素浓度对萃取分配比的影响如图6所示。取少量发酵液,稀释至低浓度范围(306.9μg/ml),调节pH为10.0,萃取分配比D为2.23,远高于图5中n=12时的D=0.48。这表明,单是浓度的下降还不足以造成D的减小;经HPLC测定,混合醇对林可霉素A和B的分离系数β相当大,在萃取实验浓度范围内,β=3～7;多级逆流萃取实验中,发酵液中原先含有的少量极性较强的林可霉素B组分在稀端逐级富集,造成A、B两组分总分配比D的下降。2.1.3萃取时间的确定碱洗目的在于除去萃取时进入有机相中的色素、无机盐、林可霉素B等杂质,以提高产品纯度。碱洗后水相可与发酵液混合后再进行萃取,而不影响产品收率。表2所示为不同相比下,模拟两级逆流洗涤实验的结果,水相为pH10.0缓冲溶液,25℃下洗涤。根据实验结果,以下是较合适的碱洗工艺条件:以pH10缓冲液在25℃下洗涤萃后有机相,两级逆流操作,VO/VA=2～3;碱洗后水相返回絮凝后发酵液,再进行萃取。2.1.4固相反萃与末级反萃按化学计量比加入盐酸,可从有机相中反萃取林可霉素,同时起到浓缩和再生溶剂的作用。由于高碳醇与水的互溶度较丁醇小得多,与原有丁醇提取工艺相比(4～6级),反萃的级数可以减少。以稀盐酸为水相对碱洗后萃取液进行反萃取,有机相效价为9159μg/ml,水相为pH2.0稀盐酸。VO/VA=3,25℃下模拟3级逆流反萃。末级反萃在搅拌下进行,用1mol/L盐酸调节pH至2.0～2.5,实验达到稳态时对各级取样分析,结果表3所示。根据以上结果,反萃取时采用2～3级逆流操作,pH调至2.0～2.5,相比VO/VA=3～5,可以保证反萃完全。2.1.5高碳醇萃取有利于减少林可霉素b含量浓缩、结晶和干燥条件参照丁醇提取工艺。反萃液减压浓缩至(2.5～3)×105μg/ml,加入活性碳脱色,过滤。滤液中分次缓慢加入9倍体积的丙酮,在4℃下静置充分析出晶体。过滤,固体用丙酮洗涤后,在50℃下真空干燥。干燥后样品经分光光度法测总效价为849μg/mg(林可霉素A盐酸盐分子式为C18H34N2O6S·HCl·1/2H2O,分子量为452,纯品效价为899μg/mg)。用HPLC法分析,成品中林可霉素B含量为1.3%,显著低于丁醇提取工艺二次结晶产品(4.2%)。这表明,由于高碳醇对极性较弱的林可霉素A有较高选择性,利用高碳醇萃取有利于降低产品中林可霉素B含量;虽然丁醇对林可霉素的萃取能力较强,但萃取选择性较低,成品中仍有较多的林可霉素B;此外,高碳醇沸点较高(>200℃),不溶于水,萃取剂的挥发和溶解损失较小;而丁醇沸点较低(117℃),且溶于水(7.4g/100g水),萃取后从萃余相中回收溶剂,须消耗较多能量。2.2醇提取工艺进一步加工以提高林可霉素b含量在保留原有丁醇提取工艺的前提下,由于市场需求,部分产品需要用混合醇提取工艺进一步加工,以降低林可霉素B含量,以满足市场上对较高纯度林可霉素原料(林可霉素B含量小于2%)的要求。为此,研究了混合高碳醇和丁醇萃取工艺结合的工艺条件,初步拟定的工艺路线如图6所示。2.2.1水相林协同萃取实验以林可霉素丁醇提取一次结晶配制成不同浓度的的溶液,用氢氧化钠溶液调节pH至10.0,以混合醇80%正辛醇∶20%正癸醇进行单级萃取(25℃),结果如图7所示。高浓度萃取操作时,分配比D较正常浓度范围中显著增大;此外,高浓度负载下(CO≥3×105μg/ml)混合醇粘度很高,这给操作和工艺控制带来困难。选择适当的水相林可霉素浓度,模拟多级萃取实验,结果如表5所示。可见,萃取操作采用两级逆流方式,相比VO/VA=0.5～1,可保证萃取收率在90%以上。2.2.2碱洗需选用的碱法为确保碱洗后有机相中林可霉素B含量足够低和产品质量达到要求,碱洗需采用较大相比。水相为pH10.0缓冲溶液,有机相浓度为(4～8)×104μg/ml,相比VO/VA=1,25℃下单级碱洗后,有机相中效价的保留率为82.7%～86.2%。2.2.3丁醇-丁醇萃取分离林可霉素b晶体结构碱洗后(单级操作)有机相浓度CO=3.5～9×104μg/ml,用1mol/L盐酸反萃,相比VO/VA=3～11。反萃后水相经减压浓缩,效价范围达到(2.5～3)×105μg/ml,加入丙酮,在4℃下充分析出结晶,晶体经过滤和用丙酮洗涤后,50℃～60℃下减压干燥。对干燥后样品进行分析,化学效价为851μg/mg;用HPLC法分析,其中林可霉素B含量为1.29%～1.78%,显著低于丁醇提取工艺一次结晶(5.2%)和二次结晶产品(4.2%)。在保留原有丁醇提取工艺的基础上,采用混合高碳醇为萃取剂,对丁醇提取所得的林可霉素粗品进行萃取纯化,可以在原有提取设备不作较大改动的前提下,大幅度地提高产品纯度,经济效益显著。对林可霉素B含量已经较低的一次结晶作进一步纯化,一般需要采取两级以上的连续逆流萃取和碱洗操作;调整萃取、碱洗和反萃操作的级数和相比等条件,可使纯化后样品满足不同纯度要求(林可霉素B≤1.5%或≤0.8%)。3混合高碳醇萃取工艺的应用(1)在优化工艺条件下,以混合高碳醇为萃取剂从发酵液中提取林可霉素,可以显著降低产品中林可霉素B组份的含量,产品中B组分为1.3%。随着林可霉素越来越多地用作半合成抗生素的原料,对其中B组分含量的要求也在提高。B组分含量小于4%的产品基本上能满足国内需求,但是出口药品中B组分含量至少应小于2%;随着B组分含量的降低,价格提高很多,市场上B组分含量小于1.5%的林可霉素产品比含4%B组分的林可霉素产品价格高出1倍以上。丁醇提取工艺中,萃取剂消耗较大;而对于高碳醇提取工艺,虽然萃取剂成本较高,但挥发和溶解损失小;综合考虑萃取操作成本和因产品价位提高带来的经济收益,混合高碳醇萃取工艺有良好的应用前景。(2)在保留原有丁醇提取工艺的同时,结合混合高碳醇萃取,对丁提工艺的一次结晶产品(5.2%B组分)进行提纯,成品中林可霉素B含量为1.29%～1.78%。在无须对原工艺的设备进行较大改动的