土壤中电子穿梭物质对异化铁还原的影响

土壤中电子穿梭物质对异化铁还原的影响

厌氧大米中的氧化铁还原是微生物诱导的还原过程，通过fe（）作为最终电子受体进行厌氧呼吸过程。水稻土中的Fe(Ⅲ)主要以各种氧化物形式存在,厌氧微生物对不同铁氧化物的利用能力有区别,其中比表面大的非晶体氧化物易于被利用,而针铁矿及赤铁矿等晶体结构的氧化物因不易与微生物菌体外膜接触则难以被利用。当Lovley等提出电子穿梭体概念后,人们对晶型氧化铁还原机理有了新的认识,即微生物不需要直接和铁氧化物接触也能进行铁还原过程。已有试验证据表明,能进行厌氧呼吸的细菌通常具有电子传递系统,从微生物菌体外膜蛋白到Fe(Ⅲ)氧化物的电子传递可以通过中间体来完成,这一中间体被称为电子穿梭物质(ElectronShuttle),其可不断地从微生物的外膜蛋白接受电子,再把电子传给Fe(Ⅲ)复合物,完成对Fe(Ⅱ)的还原。Fe(Ⅲ)还原微生物均具有还原腐殖物质或胞外醌的能力。与Fe(Ⅲ)络合的腐殖质可能是接受电子的基团,其中醌是接受电子的主要部分。这些含醌基团被微生物还原成氢醌,而氢醌可被Fe(Ⅱ)氧化再生成醌。通过这种方式,腐殖质上少量的醌通过充当Fe(Ⅱ)还原微生物和Fe(Ⅱ)氧化物之间的电子穿梭体被反复利用,从而促进Fe(Ⅲ)氧化物的还原。腐殖质是沉积物环境中含量丰富且稳定存在的一类复杂有机物,由于其结构复杂,实验室中常用其同类物蒽醌-2,6-二磺酸盐(anthraquione-2,6-disulfonate,AQDS)来研究腐殖质在异化Fe(Ⅲ)还原过程中的作用。有关研究发现,Fe(Ⅲ)还原微生物,如Geobactermetallireducens和Shewanelaalgaju均可利用AQDS作为电子穿梭物质,在微生物与金属氧化物之间高效地传递电子。因此,在实验室模拟研究中,AQDS常被用作促进Fe(Ⅲ)还原的电子穿梭体。以往的研究主要采用Fe(Ⅱ)还原微生物的纯培养试验,并且在许多铁还原菌的纯培养中均发现了类似于电子穿梭体的物质,如c-型细胞色素、醌、腐殖酸、黑色素等均可自由穿梭细胞内外,甚至携带电子穿梭于不同的微生物之间,促进铁的异化还原过程。然而,针对水稻土中电子穿梭物质与氧化铁还原关系的研究鲜有报道。除无定形氧化铁外,土壤中75%以上的铁氧化物以晶体结构存在,其中包括纤铁矿、赤铁矿、针铁矿及其铝取代物。因此研究电子穿梭体对水稻土中氧化铁的还原,无疑具有重要的理论和实际意义。本研究通过向水稻土及来源于不同土壤的微生物混合培养中添加不同浓度AQDS,探讨水稻土中的微生物对AQDS的功能响应,及其对土壤中异化铁还原过程的影响,为强化及调控水稻土中铁的异化还原过程提供必要的理论依据。1材料和方法1.1土壤有机质含量供试水稻土分别采自吉林市丰满区前二道乡(用JL表示)、四川省邛崃市回龙镇(用SC表示)、江西省安福县竹江乡(用JX表示)和浙江省宁海县梅林镇(用ZJ表示)。以上4种土壤有机质含量分别为41.2,48.9,23.9和29.6mg/kg,无定型铁含量分别为4.94,3.08,1.94和3.30g/kg,游离铁含量分别为10.01,11.69,6.48和11.9g/kg,pH分别为4.85,7.34,4.84,6.11(w(土):V(去离子水)=1:5)。土样自然风干,磨细,过孔径为1mm的土壤筛,用以制备微生物接种液和进行土壤泥浆培养试验。1.2微生物接种液分别将风干过筛的四川和浙江水稻土以m(水稻土):V(去离子水)=1:9的比例在30℃下淹水1周。培养后的土样置于离心机中,700r/min离心10min,取上清液作为微生物接种液。采用厌氧混合培养研究方法,以人工合成的Fe(OH)3为惟一电子受体,采用来源于四川和浙江的水稻土浸提液为微生物接种液。在若干10mL的血清瓶中分别加入1mL人工合成的Fe(OH)3悬液(含铁量为0.54mg/mL),加盖,121℃高温灭菌30min。冷却后,分别加入过细菌滤器(<0.22μm)后的氯化铵一磷酸盐混合溶液(含5mg/mLNH4Cl和25mmol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液)、葡萄糖溶液(50mg/mL),微生物接种液和不同浓度AQDS(0.1,0.5,4.0mmol/L)各1mL。充氮除氧,密封,置于恒温培养箱中30℃暗光培养。1.3不同浓度aqds溶液对血清的影响称取采自不同地区的风干水稻土样品3.000g若干份,置于容积为10mL的血清瓶内,分别添加不同浓度AQDS溶液(0.1,0.5,1.0,8.0mmol/L)3mL,以添加同体积无菌水处理作为对照。充氮除氧,加盖密封。于30℃恒温培养箱中暗光培养。培养过程中定期采样测定Fe(Ⅱ)浓度。1.4浸提液制备每次采样时各处理取出1瓶,充分摇匀,剔除铝盖,揭开橡胶塞,用自动加样器吸取一定体积悬液,每瓶取3次做重复。将取得的样品置于浓度为0.5mol/L盐酸溶液中,置培养箱中于30℃下浸提24h。浸提液过0.22μm滤膜,用邻菲啰啉分光光度法测定滤液中Fe(Ⅱ)浓度。2结果与分析2.1添加aqsd对异构铁还原的影响2.1.1还原作用机理:不同来源微生物对fe3的还原能力分别以SC、ZJ水稻土浸提液作为微生物接种液,以微生物易于利用的Fe(OH)3为惟一电子受体,以葡萄糖为惟一电子供体,研究AQDS对异化铁还原过程的影响,结果见图1。由图1可知,添加AQDS处理的Fe(OH)3还原速率较对照明显增加,且添加的AQDS浓度越大,AQDS对Fe(OH),还原的促进作用越明显。证实了在体系中AQDS作为电子穿梭体起传递电子的作用,加速了Fe(Ⅲ)的还原。由图1还可以看出,SC水稻土中的微生物对Fe(OH)3的还原速率明显比ZJ水稻土的快,表明不同来源的微生物对Fe(OH)3的还原能力具有一定的差别。此外,在反应过程中ZJ水稻土的微生物对AQDS比较敏感,其Fe(Ⅱ)浓度的增加速率较大。但各处理中无论异化铁还原发生早或晚、速率快或慢,Fe(Ⅱ)浓度均能达到一个稳定水平,而且Fe(Ⅱ)浓度的稳定值与初始体系中Fe(OH)3浓度(0.54mg/mL)接近,说明在电子供体充足的情况下,Fe(OH)3的最终还原量不受AQDS加入量的影响,即对于易还原的Fe(OH)3来说,AQDS的促进作用主要是增加Fe(OH)3还原反应速率。2.1.2对fe生成速率的影响4种水稻土中添加不同浓度AQDS对异化铁还原过程的影响如图2所示。由图2可知,添加AQDS不仅影响水稻土中Fe(Ⅲ)的还原速率,而且对Fe(Ⅲ)的最终还原量(用Fe(Ⅱ)的生成量表示)有显著的影响。同时,AQDS在不同土壤中的表现也存在一定差异。其中在JX、SC和ZJ水稻土中,添加AQDS均能明显提高土壤中Fe(Ⅱ)的生成速率,在培养10d内,Fe(Ⅱ)的生成量明显增大。在培养后期,Fe(Ⅱ)的最终生成量也明显高于对照,表明AQDS对促进土壤中部分晶体态氧化铁的生物还原具有重要作用。土壤中Fe(Ⅱ)的生成量基本上随AQDS浓度的增加而增大,仅在SC水稻土中高浓度(8.0mmol/L)AQDS处理较其他浓度AQDS处理略有降低,但明显高于CK。添加不同浓度AQDS后不同水稻土对Fe(Ⅱ)生成速率的敏感性高低顺序为:SC>JX>ZJ.最终Fe(Ⅱ)生成量的大小顺序为:JX>ZJ>SC。在JL水稻土中,添加不同浓度AQDS后,其对Fe(Ⅱ)的生成基本上均有抑制作用。在培养10d内,Fe(Ⅱ)的生成量及其速率小于或与CK接近,仅低浓度(0.1mmol/L)AQDS处理在培养后期的Fe(Ⅱ)生成量较CK略有增加。在整个培养期间高浓度(8.0mmol/L)AQDS处理的Fe(Ⅱ)生成量明显低于对照。这可能与土壤本身的有机质性质及土壤中铁还原微生物特征有关。2.2对不同aqds的响应异化Fe(Ⅱ)还原是微生物介导的生物学过程,与微生物的生长密切相关,所以可用表征微生物生长动力学的Logistic方程描述。Logistic方程的表达式为:Y=a/[1+b·exp(-cx)]。用Logistic方程拟合的Fe(Ⅲ)还原过程的参数见表1,2。利用参数a可得出Fe(Ⅲ)还原的最大Fe(Ⅱ)累积量;参数c表示还原速率常数;用参数a和c可求出最大反应速率Vmax,其数值等于0.25ac;最大反应速率对应的时间TVmax,数值为lnb/c;r和s分别表示相关系数和偏差。由表1可知,在微生物混合培养试验中,Fe(OH)3还原速率常数(c)和最大反应速率(Vmax)均随AQDS浓度的增加而增大。在ZJ水稻土中,0.1,0.5和4.0mmol/LAQDS处理的Fe(OH)3还原速率常数(c)分别是对照的1.60,2.64及8.51倍,最大反应速率对应的时间(TVmax)较CK分别提前了0.77,1.49和2.08d;在SC水稻土中,0.1,0.5和4.0mmol/LAQDS处理的Fe(OH)3还原速率常数(c)分别是对照的1.56,2.28和2.41倍,最大反应速率对应的时间(TVmax)较CK分别提前了0.29,0.35和0.93d。对比2种来源微生物的Fe((OH)3还原过程,ZJ水稻土对AQDS的响应较SC水稻土更为敏感。由表2可见,AQDS对不同水稻土中Fe(Ⅲ)还原的影响存在差异。在4种水稻土中,除JL水稻土中8.0mmol/LAQDS处理外,其他AQDS处理表征Fe(Ⅱ)还原潜势的最大Fe(Ⅱ)累积量均较对照增加,增加比例分别为:JL104%～108%,JX107%～123%,SC102%～104%,ZJ102%～108%。随着AQDS浓度的增加,在JX和ZJ水稻土中的a值不断增大,其中在JX水稻土中的增加幅度最大;JL和SC水稻土的a值逐渐减小。a值增大说明土壤中被还原的Fe(Ⅲ)量增加,与CK相比增加的量主要是土壤中的晶体氧化铁。上述结果显示,AQDS对促进土壤中晶体氧化铁的还原具有重要作用。AQDS对不同土壤中Fe(Ⅲ)还原速率常数(c)的总体影响趋势表现为:随着AQDS浓度增大,Fe(Ⅲ)还原速率常数(c)占CK的比例基本上降低,其中JL水稻土为37%～88%,JX水稻土为158%～203%,SC水稻土为115%～282%(0.5mmol/LAQDS处理除外),ZJ水稻土为146%～208%,在SC水稻土中较低浓度的AQDS处理对Fe(Ⅲ)还原速率常数(c)影响增大,如0.5mmol/LAQDS处理占CK的比例可达379%,而在JL水稻土中AQDS处理的Fe(Ⅱ)还原速率常数(c)均低于CK,8mmol/LAQDS处理仅是CK的37%。这可能与土壤有机质性质及其含量有关。不同AQDS处理的Vmax与Fe(Ⅲ)还原速率常数(c)的变化趋势相似。当AQDS对Fe(Ⅲ)还原过程具有促进作用时,均表现为TVmax减小。通常氧化铁还原与土壤的有机质含量有关。供试的JL、SC、JX和ZJ水稻土中有机质含量分别为41.2,48.9,23.9和29.6mg/kg,与表2中铁还原最大累积量(a)比较可知,JX、ZJ和JL水稻土中铁还原最大累积量(a)均随着有机质含量的增加而增大。但对SC水稻土而言,与JL水稻土相比尽管其有机质含量很高,但其铁还原最大累积量(a)却较低。这可能是由于SC水稻土属于石灰性土壤,其有机质的性质及对土壤颗粒表面性状的影响与其他3种土壤有所区别,大量存在改变了土壤颗粒表面有机质的分布与包裹状态,致使铁还原过程的最大Fe(Ⅱ)累积量降低。另外,本试验中发现,在有机质含量高的土壤(JL)中添加AQDS,随着AQDS浓度的增加,最大Fe(Ⅱ)累积量有降低的趋势。这可能是土壤中原有的腐殖质充当了铁还原电子穿梭体,添加AQDS反而抑制了微生物的活性。在SC水稻土中,AQDS导致的Fe(Ⅱ)还原速率常数(c)和最大反应速率(Vmax)的变幅最大,这可能与不同浓度AQDS的pH变化有关。随着AQDS浓度的增加,其pH不断降低(图3)。异化Fe(Ⅱ)还原是微生物介导的酶促还原过程,微生物生长有其适宜的pH范围,酶促还原反应也有最佳的pH值。因此,环境中的pH会直接影响异化Fe(Ⅱ)还原过程。SC水稻土是石灰性土壤,过低pH必然会影响到土壤本身的微生物区系和活性,导致异化铁还原的Fe(Ⅲ)还原速率常数(c)和最大反应速率(Vmax)降低。3添加aqds的浓度腐殖质是沉积物和土壤中稳定存在的有机物聚积体。虽然腐殖质一直被认为对微生物引起的异化还原作用无明显促进作用,但有研究指出,微生物在非溶性氧化铁还原条件下氧化有机物质,可以通过添加腐殖质或醌族有机物来刺激该反应。腐殖质类物质在铁还原微生物、铁氧化物及有机物之间可以非生物性的转移电子给Fe(Ⅲ)氧化物,使Fe(Ⅲ)还原为Fe(Ⅱ)。由于其所具有的这种电子穿梭性能,克服了铁还原菌和铁氧化物之间必须物理性接触的限制条件,加速了铁还原。本研究中,微生物混合培养和泥浆培养试验均表明,AQDS在Fe(Ⅲ)还原过程中作为电子穿梭体起传递电子的作用,加速了Fe(Ⅲ)还原。关于添加AQDS的浓度范围,国外针对微生物的纯培养研究较多。Lovley等报道,低浓度(50μmol/L)的AQDS可促进铁氧化物与P.islandiucn之间的电子传递,极大促进弱晶体铁氧化物的还原,且随着AQDS浓度(0～500μmol/L)的增加,促进